Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Sistemas de expressão heteróloga é uma das técnicas mais amplamente utilizado para estudar uma multiplicidade de funções celulares ^1. Seu perfil baixo endógena de proteína, os requisitos mínimos de manutenção, o crescimento confiável e capacidade de assumir e expressar DNA estranho fizeram linhas celulares tais como embrionárias humanas de rim (HEK293) e ovário de hamster chinês (CHO) quase essencial para a pesquisa biológica ^{2, 3.} Áreas de pesquisa usando sistemas heterólogos incluem proteínas de membrana, sinalização intracelular e atividade enzimática. A seguir à transfecção de ADN estranho na célula, muitas formas diferentes de análise pode ser realizada, incluindo a electrofisiologia, imagem de cálcio raciométrica, western blot, etc ^{4, 5.}

Devido à grande variedade de aplicações potenciais para sistemas de expressão heterólogos, muitos difereReagentes e produtos nt foram desenvolvidos para utilizar estas células e as suas qualidades ^6. sistemas de entrega de DNA que transitoriamente ou permanentemente integrar DNA estranho em células para estudar proteína exógena tornou-se uma das ferramentas mais populares e úteis para a pesquisa biológica. Mais especificamente, a transfecção transiente de ADN para uma célula é amplamente usado como um processo para a frente simples, linear que requer relativamente pouco tempo e materiais. Além disso, a taxa de sucesso de células que sofrem transfecção é alta ^7. Esta técnica é muito fiável quando combinado com um gene marcador tal como a proteína fluorescente verde (GFP), e pode ser usado para muitas técnicas diferentes, como a imagiologia de cálcio e electrofisiologia ^5. Infelizmente, no entanto, que expressam transitoriamente o DNA em células hospedeiras vem com alguns dos principais armadilhas, não menos que o nível de expressão por célula não é fiável. O número de cópias do DNA de plasmídeo feita up por célula é incontrolável, assim, a expressão entre experiências individuais podem variar muito ^2. Esta questão torna-se significativo quando quer tentar replicar condições fisiológicas, ou a realização de técnicas precisas de coleta de dados.

Como uma solução para as complicações acima mencionadas, os protocolos de transfecção estável foram concebidos em que um gene de interesse pode ser inserido no genoma de uma célula sob o controlo apertado de um promotor indutível, tal como um sistema de tetraciclina repressor expressão, assegurando uma única cópia do plasmídeo se integra no genoma de cada célula e só é expressa após a indução do mecanismo de transcrição, por exemplo, na presença de doxiciclina. Enquanto isso resolve os obstáculos de níveis de expressão de proteína inconsistentes, este método perde a conveniência de protocolo rápido e relativamente simples de transfecções transitórias. O estabelecimento de uma linha de células estável leva pelo menos algumas semanas em which uma necessário calibrar uma curva de morte definido por antibióticos específicos para manter a expressão da proteína e assegurar a integração do vector e habilmente seleccionar e fazer crescer colónias de células. No geral, isto leva muito mais tempo e esforço com uma menor taxa de sucesso ^8.

Aqui, apresentamos um protocolo intermediário que tem por base os pontos fortes de ambas as opções de transfecção populares para fornecer uma maneira simples e eficaz para controlar os níveis de expressão em qualquer linha de células inducible. Enquanto se mantém as células com um sistema tet indutível, que transientemente transfectar nosso gene de interesse, transiente do receptor potencial canal de catião membro da subfamília V 1 (TRPV1), ligado a um vector que pode homologamente combinar com o sistema de repressor. Deste modo, o gene pode ser introduzido nas células sem começando a expressar. Apenas com a adição de doxiciclina não o gene começam a expressar, o que nos permite calibrar os níveis de proteína exprESSÃO de acordo com a técnica ou níveis observados em condições fisiológicas. Nosso protocolo também evita complicações associadas à geração de longas uma linha celular que expressa de forma estável. Começamos mostrando alteração dos níveis de ativação de TRPV1 na imagem de cálcio a partir de-un induzida através de quatro horas de indução e como o aumento dos níveis de cálcio intracelular está correlacionado. Em seguida, duplicar o protocolo em toda a configuração da célula da técnica de patch-clamp, mostrando o aumento da corrente com o tempo de indução a aumentar. Por fim, apresentamos exemplos de gravações de eletrofisiologia único canal, e mostrar que esta técnica é especialmente útil para a expressão controlada quando se olha para a coleta de dados precisos com base em unidades individuais da proteína. Através do nosso protocolo, que oferecem um modo conveniente de controlar a expressão de proteínas em sistemas heterólogos, evitando longas complicações de cultura de células, proporcionando assim uma maneira de controlar as condições de entre experiências e fornecer MOre resultados replicáveis.