Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Heteróloga expresa sistemas es una de las técnicas más utilizadas para el estudio de una multitud de funciones celulares ^1. Su perfil bajo proteína endógena, los requisitos mínimos de mantenimiento, el crecimiento fiable, y la capacidad de captar y expresar ADN foráneo han hecho líneas celulares tales como embrionarias de riñón humano (HEK293) y de ovario de hámster chino (CHO) casi imprescindible para la investigación biológica ^{2, 3.} Las áreas de investigación incluyen el uso de sistemas heterólogos proteínas de membrana, la señalización intracelular y la actividad enzimática. Después de la transfección de ADN extraño en la célula, muchas formas diferentes de análisis se pueden realizar, incluyendo electrofisiología, imágenes de calcio radiométrico, western blot, etc. ^{4, 5.}

Debido a la amplia gama de posibles aplicaciones para los sistemas de expresión heteróloga, muchos diferereactivos y productos nt se han desarrollado para utilizar estas células y sus cualidades ^6. Los sistemas de administración de ADN que se integran de forma transitoria o permanente de ADN extraño en células para estudiar la proteína exógena se ha convertido en una de las herramientas más populares y útiles para la investigación biológica. Más específicamente, transitoriamente la transfección de ADN en una célula se utiliza ampliamente como un proceso hacia delante simple, recta que requiere relativamente poco tiempo y materiales. Por otra parte, la tasa de éxito de las células que se someten a transfección es alta ^7. Esta técnica es muy fiable cuando se combina con un gen marcador tal como la proteína fluorescente verde (GFP), y se puede utilizar para muchas técnicas diferentes, tales como imágenes de calcio y electrofisiología ^5. Lamentablemente, sin embargo, que expresan transitoriamente el ADN en las células huésped viene con algunas de las dificultades principales, no en el menos que el nivel de expresión por célula no es fiable. El número de copias de ADN plásmido tomada up por célula es incontrolable, por lo tanto la expresión entre los experimentos individuales puede variar mucho ^2. Este problema se vuelve significativo cuando sea tratando de reproducir las condiciones fisiológicas, o la realización de las técnicas de recolección de datos precisos.

Como una solución a las complicaciones mencionadas anteriormente, los protocolos de transfección estables han sido diseñados en el que un gen de interés se puede insertar en el genoma de una célula bajo el estricto control de un promotor inducible, tal como un sistema de expresión represor de la tetraciclina, asegurando una sola de copias del plásmido se integra en el genoma de cada célula y sólo se expresa después de la inducción del mecanismo de la transcripción, por ejemplo, en presencia de doxiciclina. Aunque esto resuelve los obstáculos de los niveles de expresión de proteínas inconsistentes, este método pierde la comodidad de protocolo rápido y relativamente simple de transfecciones transitorias. El establecimiento de una línea celular estable que lleva por lo menos un par de semanas en which hay que calibrar una curva de muerte establecido por antibióticos específicos para mantener la expresión de la proteína y asegurar la integración del vector y hábilmente seleccionar y hacer crecer las colonias de células. En general, esto toma mucho más tiempo y esfuerzo con una menor tasa de éxito ^8.

A continuación, presentamos un protocolo intermedio que se basa en los puntos fuertes de las dos opciones de transfección populares para proporcionar una manera simple y eficaz para controlar los niveles de expresión en cualquier línea celular inducible. Mientras se mantiene células con un sistema de tet inducible, transitoriamente transfectar nuestro gen de interés, Transient Receptor canal catiónico miembro de la subfamilia V Potencial 1 (TRPV1), se ligó en un vector que se puede combinar de forma homóloga con el sistema de represor. De esta manera, el gen se puede introducir en las células sin empezar a expresar. Sólo con la adición de doxiciclina no el gen comienzan a expresar, lo que nos permite calibrar los niveles de proteína exprEssion según la técnica o niveles observados en condiciones fisiológicas. El protocolo también evita largas complicaciones asociadas con la generación de una línea celular que expresa de forma estable. Comenzamos mostrando los niveles cambiantes de la activación TRPV1 en imágenes de calcio desde un-inducida a través de cuatro horas de la inducción y la forma en que el aumento de los niveles de calcio intracelular se correlaciona. A continuación, duplicar el protocolo en toda la configuración de la celda de la técnica de patch clamp, que muestra la corriente aumenta con el tiempo de inducción en aumento. Por último, se presentan ejemplos de grabaciones de electrofisiología de un solo canal, y demostrar que esta técnica es especialmente útil para la expresión controlada en la búsqueda de la recopilación de datos precisos sobre la base de las unidades individuales de la proteína. A través de nuestro protocolo, ofrecemos una manera conveniente de controlar la expresión de proteínas en sistemas heterólogos, evitando las complicaciones de cultivo de células largas, proporcionando así una manera de controlar las condiciones entre los experimentos y proporcionar movolver a resultados reproducibles.