ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

注：このプロトコルで使用される全ての試薬用にベンダー情報は、表1に列挙されています。細胞は、それらとの直接接触を持つようにしている場合、すべてのメディア/プレートは無菌であり、少なくとも室温であるべきです。 1.継代ヒト多能性幹細胞（hPSCs）ラミニン521へ注：以下に記載する細胞継代手順は、単一の細胞に基づくとhPSCsから肝細胞様細胞の均一な集団の誘導のための理想的です。コロニーめっきも適用可能であり、以前に24に記載されています。 必要に応じて、ラミニンコーティングしたプレートを準備します。 4°Cで組換えラミニン521（LN-521）の100μg/ mLのストックを解凍します。 氷冷1×DPBS中で解凍LN-521を希釈（のCa 2+ / Mgが2+）を5μg/ mL溶液を作製しました。 6ウェルプレートのコート1ウェルに/ mLのLN-521の溶液を5μgの1 mLを加えそしてウェル中に均等にそれを広めるために岩。 緊急の使用のための、または一晩4℃の冷蔵庫で4時間- 2、37℃/ 5％CO 2細胞培養インキュベーター中で培養します。 必要に応じて、4℃の冷蔵庫にラミニンコートプレートを保管してください。平らな面にプレートを維持し、蒸発や汚染を避けるためにそれらを封印。 注：被覆ウェルを乾燥させないでください。必要に応じて、余分な1×DPBS（のCa 2+ / Mgの2+）とそれらをトップアップ。 2週間以内にプレートを使用してください。 1時間 – プレコーティングしたプレートの必要な数は、使用前に室温に到達または0.5、37℃でプレートをインキュベートすることを許可します。 慎重にコーティングされた表面に損傷を与えることなくコーティングLN-521の溶液を吸引します。注：その上に細胞を播種する前に、コーティングされた表面を傷つけないように重要です。 すぐに10μMのRho関連キナーゼ（ROCK）阻害剤Y2を補っ予め温め-mTeSR1培地の1 mLを加え6ウェルプレートの1ウェルに7632。セルを受信するために、細胞培養インキュベーター中でプレートを残します。 注：ラミニン被覆ウェルを乾燥させないでください。 約75％〜85％の集密度で手入れの行き届いたhPSCsから培地を吸引除去します。室温1X DPBS 1mLの（なしのCa 2+ / Mgの2+）で1回6ウェルプレートの1つのウェルから細胞を洗浄します。 細胞への1xのAccutaseの0.5 mLを加え6、37℃でインキュベート – 細胞を解離するために8分。 注：、消化が十分な長さであるかどうかを確認やさしくプレートをタップして、細胞が簡単に取り外すことができるかどうかを確認するには。 yesの場合は、酵素反応を停止する時間です。 2分 – いない場合は、余分な1のための消化を拡張します。 細胞に10μMのY27632を補った新鮮なmTeSR1培地2mLのを追加することによって解離を終了します。ピペットアップおよび単一細胞懸濁液を作製するためにP1000チップを数回使用してダウン。 血球計数器を使用して生細胞を数えます。死細胞14を染色し、排除するためにトリパンブルーを使用して、 必要な細胞の総数を計算します。ルーチンHPSCの継代のために、6ウェルプレートのウェルあたり4×10 5×10 5個の細胞を播種する（ すなわち、4.21×10 4、1cm 2当たり5.26×10 4）。肝細胞分化にhPSCsを継代するために、6ウェルプレートのウェルあたり6.5×10 5〜7.5×10 5（ すなわち、1cm 2当たり7.89×10 4から6.84×10 4）細胞を播種します。 注：各細胞株についての播種密度は、肝臓の分化のためにここに与えられた経験的な密度に基づいてマイナーな最適化が必要になる場合があります。 室温で3分間115×gで滅菌15ミリリットルまたは50-mL遠心チューブと遠心分離機に必要な細胞懸濁液を転送します。 ゆっくり上清を吸引除去した後、10μMのRho関連キナーゼ（ROCK）inhibitoを補った新鮮な、温かいmTeSR1培地中で細胞ペレットを再懸濁R Y27632、所望の細胞密度を作るために適切な培地を用いて。 注：ROCK阻害剤の使用は、高度に細胞の付着および生存率を高めるために推奨されます。 準備されたプレートに細胞を播種すると細胞を均一に分配するために前後左右にそれらを揺すります。 注：細胞がプレートは、ルーチンの細胞培養または肝細胞の分化実験のためであるかどうかのウェルに均等に分配されることを保証することが重要です。 細胞インキュベーターでプレートを置き、それらを添付して回復できるようにするために24時間、37℃/ 5％CO 2で細胞を維持します。 翌日、細胞を検査し、細胞 – 細胞接触が確立されている場合にはROCK阻害剤を引き出します。ルーチン培養にmTeSR1培地中で細胞を維持するか、必要に応じて分化培地に切り替えます。 注：細胞が挙げ密度で接種した場合、密集度は、定期的なメンテナンスや肝細胞のための理想的であるべきdifferentiation個。 2.組換えラミニン上の肝細胞様細胞にhPSCsを区別分化培地を準備します。 人間のアクチビンAの原液を作成します。人間のアクチビンを無菌の0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）/ DPBS中100μg/ mLのストック溶液を作るために粉末を溶かします。少量のアリコートを作成し、-20℃で保管してください。 1で使用してください：1,000。 マウスのWnt 3aの原液を作る：滅菌0.2％BSA / DPBS中10μg/ mLのストック溶液を作るために、マウスのWnt 3aの粉末を溶解します。少量のアリコートを作成し、-20℃で保管してください。 200：1で使用してください。 ヒト肝細胞増殖因子（HGF）のストック溶液を作る：無菌の0.2％BSA / DPBS中の10μg/ mLのストック溶液を作製するために、ヒトHGFの粉末を溶解します。少量のアリコートを作成し、-20℃で保管してください。 1で使用してください：1,000。 オンコスタチンM（OSM）原液を作る：滅菌0.2％BSA / DPBS中に20μg/ mLのストック溶液を作るためにオンコスタチンM（OSM）粉末を溶解します。小分けとsを作ります-20℃でそれらを引き裂きました。 1で使用してください：1,000。 内胚葉プライミングストック培地500mlを作る：2％のB27サプリメント（50X、 マイナスビタミンA）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（それぞれ100 IU / mLおよび100μg/ mLの時の最終濃度）。ロズウェルパーク記念研究所1640（1640 RPMI）基礎培地を使用して500 mLにトップアップ。注：4°Cでの在庫を保管し、2週間以内に使用します。アリコートストックからの培地および各培地交換で（それぞれ100 ngの/ mLおよび50 ngの/ mLの最終濃度）新鮮なアクチビンAおよびWnt 3aに追加します。 KSR / DMSO分化培地500mlを作る：80％ノックアウトDMEM（KO-DMEM）、20％ノックアウト血清代替物（KSR）、0.5％グルタ、1％非必須アミノ酸（NEAA）、0.1 mMのβ-メルカプトエタノール、 1％のDMSO、及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン（100 IU / mLおよび100μg/ mLの、それぞれの最終濃度）。真空下でフィルタします。 4℃で保存し、2週間以内に使用します。 1％のGI：HepatoZYMEの成熟培地の500ミリリットルを作りますutaMAX、10μMのヒドロコルチゾン21-ヘミスクシネートナトリウム塩（HCC）、および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（それぞれ100 IU / mLおよび100μg/ mLの最終濃度で）。トップアップHepatoZYME基礎培地を用いて、500 mLです。注：4°Cでの在庫を保管し、2週間以内に使用します。アリコートストックからの培地および各培地交換のための（10ng / mLのおよび20 ng / mLで、それぞれに最終濃度）新鮮なHGFおよびOSMを追加します。 LN-521の肝細胞分化のためのシードhPSCs、項1に記載のようにLN-521 / LN-111を基板として使用する場合、コートLN-521およびLN-111とプレート（1：3比）で5μg/ mlの最終ラミニン濃度;残りの処理は、純粋なLN-521コートプレートと同じである必要があります。 注：LN-521 / LN-111はhPSCsのルーチン培養のための理想的ではありません。それは、分化実験のために使用されます。 播種後の細胞集密度24時間を確認してください。細胞集密度が約40％に達すると細胞分化を開始します。 Remove mTeSR1媒体過ごし、100ng / mlのアクチビンAおよび50 ngの/ mLのWntシグナル3aとを補充し、新鮮な内胚葉吸式メディアを追加します。この分化日1呼び出します。 注：非常に細胞を播種した翌日分化を開始することをお勧めします。 内胚葉吸式培地にヒト胚性幹細胞（hESC）のための3日間、24時間毎に変更してください。人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）については、胚体内胚葉様細胞に首相に2日間以上の細胞をこの段階を拡張するが、これらの2日間12のみを100ng / mLのアクチビンAを補っ内胚葉プライミング媒体を用います。 注：成功した内胚葉の仕様を確保するためには、そのようなFOXA2及びSOX17などの内胚葉マーカーの発現を調べることができます。免疫蛍光染色によると、誘導された細胞の80％以上が私たちの研究室で、両方のマーカーに陽性です。 4日目（hiPSCs用）（ヒトES細胞用）/ 6日目にKSR / DMSO分化培地に切り替えます。媒体Dを変更最初の3日間、その後、この分化段階の5日目aily。 注：なし給はこの分化段階の4日目に必要とされません。多くの死細胞が存在する場合の培地交換の前に細胞を1回洗浄するために非補足KO-DMEMを使用してください。このステージのための差別化が成功したかどうかを確認するには、1は、AFP、CK19、およびHNF4Aなどの肝前駆細胞マーカーの発現をテストすることができます。細胞の約90％は、我々の経験に基づいて、これらのマーカーに陽性となります。 KSR / DMSOの分化段階の5日後、HepatoZYMEの成熟段階に切り替えます。 KSR / DMSO媒体を除去した後、プレーンHepatoZYME基礎培地で細胞を1回洗浄します。 10ng / mLのHGFおよび20 ng / mLのOSMを補足しHepatoZYMEの成熟培地を追加します。 細胞は、標準的な特性評価やさらなる使用のために準備ができているこの時点で10日、 – 7用の培地を48時間毎に変更してください。 注：肝細胞マーカー発現試験、代謝、尿素およびアルブミン分泌試験、糖原テスト、およびインドシアニングリーン（ICG）の取り込み試験（例えば、シトクロムP450活性のような）機能試験は、典型的な特性評価法です。 注：分化プロトコルのタイムラインは、図5に示されています。私たちの研究室では、我々は日常的に派生HLCS「肝細胞特異的なマーカーの発現レベル、アルブミンの分泌、およびシトクロムP450（CYP）3Aおよび1A2の活性を確認してください。