Cinética de la síntesis de ADN de hebra Quedando<em> In Vitro</em> Por el bacteriófago T7 proteínas de replicación
Özet
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
La replicación del ADN es una característica conservada de toda la vida celular. Mientras que la identidad y el número de componentes de replicación varían ampliamente, los mecanismos generales se comparten a través de la evolución 1. A continuación, describimos, experimentos cinéticos discontinuos a base de gel, utilizando sustratos radiactivos, dirigidas a la comprensión de la cinética de la síntesis de ADN de hebra retrasada in vitro por los componentes de la replisome T7. La maquinaria de replicación del bacteriófago T7 es muy simple, que consiste en sólo cuatro proteínas (la ADN polimerasa, GP5, y su factor de procesividad, E. coli tiorredoxina, los gp4 bifuncionales primase-helicasa, y la proteína de unión de ADN de una sola hebra, GP2. 5) 2. Esta característica lo convierte en un sistema modelo atractivo para estudiar los mecanismos bioquímicos conservados implicados en la replicación del ADN.
Se hace especial hincapié en la formación de cebadores de ribonucleótidos por T7 ADN primasa, una critical paso en la iniciación de la síntesis de ADN. Además, también se puede examinar el uso de estos cebadores por ADN polimerasa de T7 o de otras proteínas de replicación mediante su inclusión en la mezcla de reacción. La T7 primasa-helicasa, GP4, cataliza la formación de cebadores para la síntesis de ADN en secuencias específicas de ADN denominadas sitios de reconocimiento primase, o PRS, (5'-GTC-3 '). La citosina en el PRS es críptica, es esencial para el reconocimiento del sitio, pero no se copia en el producto 3. El primer paso en la síntesis de cebador mediante gp4 implica la formación del dinucleótido pppAC, que luego se extiende a un trímero, y eventualmente a cebadores tetranucleotide funcionales pppACCC, pppACCA, o pppACAC dependiendo de la secuencia en la plantilla 4. Estos cebadores pueden usarse entonces por ADN polimerasa de T7 para iniciar la síntesis de ADN, que es también un proceso gp4 asistida 5, 6. En este sentido, la primasadominio estabiliza los tetraribonucleotides extremadamente cortos con la plantilla, lo que impide su disociación, se dedica ADN polimerasa de una manera conducente a asegurar el cebador / plantilla en el sitio activo de la polimerasa 7. Estos pasos (síntesis de ARN del cebador, de traspaso cebador para la polimerasa, y de extensión) se repiten en múltiples ciclos para replicar el filamento de revestimiento y deben coordinarse con la replicación de la hebra que lleva.
Los ensayos descritos aquí son altamente sensibles y pueden realizarse en un marco de tiempo moderado. Sin embargo, son relativamente de bajo rendimiento y gran cuidado debe ejercerse en el uso y desecho de materiales radiactivos. Dependiendo de la velocidad a la que transcurre la reacción, se puede emplear un instrumento de rápido enfriamiento para alcanzar muestras a escalas de tiempo susceptibles de un análisis significativo de los cursos de tiempo de reacción, ya sea en la constante o el estado pre-estacionario. Recientemente, hemos utilizado ensayos descritos aquí para proporcionar evidence de la importancia de la liberación de imprimación desde el dominio de primasa de GP4 en la iniciación de los fragmentos de Okazaki. Además, se encontró evidencia de un papel regulador de la proteína T7, gp2.5 de unión al ADN de una sola cadena, en la promoción de la formación y la utilización eficiente de imprimación 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
El factor más importante en la realización de estos experimentos es la disponibilidad de enzima purificada de gran actividad. Durante nuestro trabajo con GP4, por ejemplo, se encontró que el almacenamiento de la enzima purificada en tampón (20 mM de fosfato de potasio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) que contiene 50% de glicerol a -20 ° C conduce a una reducción en la actividad específica del preparado durante unos meses. Por lo tanto, ahora flash congelación pequeñas alícuotas de gp4 purificada en 25 mM Tris-H…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
Referanslar
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA replication. , (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
