使用生物素化补骨脂素全球定位RNA-RNA相互作用

研究大分子如何折叠和相互作用是理解细胞中基因调控的关键。在过去十年中，为了了解DNA和蛋白质如何促进基因调控，在过去十年中已经做了很多努力，对基因表达的转录后调控相对较少。 RNA在其线性序列及其二级和三级结构中携带信息¹ 。与其自身和其他物质配对的能力对于其在体内的功能是重要的。高通量RNA二级结构探测的最新进展已经为转录组2,3,4,5,6,7,8中的双链和单链区域的位置提供了宝贵的见解关于配对互动伙伴关系的信息仍然很大程度上缺失。为了确定哪个RNA序列与转录组中的另一个RNA区域相互作用，我们需要全球成对的信息。

以全球，公正的方式映射成对的RNA相互作用传统上是一个重大的挑战。虽然以前的方法，如CLASH ⁹ ，hiCLIP ¹⁰和RAP ¹¹被用来以大规模的方式鉴定RNA相互作用，但是这些技术通常将RNA碱基配对映射到与特定蛋白质或RNA物种相互作用的RNA亚类。研究全球RNA相互作用的最新进展包括方法RPL ¹² ，其不能在体内稳定RNA相互作用，因此可能仅捕获体内相互作用的子集。为了克服这些挑战，我们和其他人开发了全基因组，无偏见的策略p RNA 在体内相互作用，使用修饰版本的交联剂补骨脂素^13,14,15 。在本协议中，我们描述了使用生物素化的补骨脂素在体内交联碱基配对RNA，然后进行邻近连接和高通量测序的P soralen交联，Ligigated和S选择Hyrbrids（SPLASH）的S等位基因的细节。识别RNA基因配对伙伴全基因组（ 图1 ） ¹⁵ 。

在本手稿中，我们描述了使用培养的贴壁细胞进行SPLASH的步骤，在这种情况下是HeLa细胞。相同的方案可以容易地适应于悬浮哺乳动物细胞和酵母和细菌细胞。简言之，HeLa细胞用生物素化的补骨脂素处理并在365nm下照射以在体内交联相互作用的RNA碱基对。然后从细胞中提取RNA，用链霉抗生物素蛋白珠片段碎片化并富集交联区域。然后使用接近连接将相互作用的RNA片段连接在一起，并制成用于深度测序的cDNA文库。测序后，将嵌合RNA映射到转录组/基因组上以鉴定彼此配对的RNA相互作用区域。我们已经成功地利用SPLASH在酵母和不同人类细胞中识别数千个RNA相互作用，包括分子内和分子间RNA碱基配对在不同类别的RNA，如snoRNA，lncRNA和mRNAs，以瞥见结构组织和相互作用模式的细胞中的RNA。