Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen
Özet
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
De zuivering van actief eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur-complexen is cruciaal voor de karakterisering van enzymatische activiteiten en de novo identificatie van nieuwe subeenheden en post-translationele modificaties. Bacteriële systemen zorgen voor de expressie en zuivering van diverse interne polypeptiden en eiwitcomplexen. Echter, dit systeem de zuivering van eiwit subeenheden die post-translationele modificaties (bijvoorbeeld fosforylatie en acetylatie) bevatten, en de identificatie van nieuwe regulerende subeenheden die alleen aanwezig zijn / expressie in eukaryote systeem mogelijk. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van een nieuw, robuuste en efficiënte werkwijze tandem affiniteitszuivering (TAP) middels Strep- en FLAG-gemerkte eiwitten die de zuivering van eiwitcomplexen maakt met transiënt of stabiel tot expressie epitoop-gemerkte eiwitten van eukaryote cellen. Dit protocol kan worden toegepast op prot karakteriserenein complexe functionaliteit, post-translationele modificaties op complexe subeenheden ontdekken en op nieuwe regulerende complexe componenten identificeren met massaspectrometrie. Met name kan dit TAP toegelicht voor eiwitcomplexen gevormd door eukaryote of pathogene (viraal en bacterieel) componenten bestuderen, hetgeen aldus een breed scala aan downstream experimentele mogelijkheden. Wij stellen onderzoekers met eiwitcomplexen deze benadering op verschillende manieren kunnen gebruiken.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn cruciaal voor de nauwkeurige regeling van biologische processen 1, en bestudeerd deze IPP kan informeren over de functie 2. Verscheidene benaderingen zijn ontwikkeld voor het karakteriseren van protonpompremmers en voor de de novo identificatie van nieuwe regulerende eiwitcomponenten. In 1989, Stanley Velden en collega's meldde de gist-twee-hybride (Y2H) test 3. Deze aanpak maakt het mogelijk om onpartijdige en uitgebreide identificatie van interactoren (prooien) voor een bepaald eiwit van belang (aas) in Saccharomyces cerevisiae. Naast de opmerkelijke bruikbaarheid voor het ontdekken PPI kan de Y2H assay worden gebruikt voor het karakteriseren van eiwitten paren in gistcellen, definiëren minimale interactie domeinen en identificeren van mutaties die dergelijke interacties te heffen. Door wijziging van de Y2H assay kan IPP eveneens bestudeerd in zoogdiercellenclass = "xref"> 4. Variaties van de Y2H assay (bijvoorbeeld gist drie-hybride systeem) kan ook worden toegepast om te bestuderen eiwit-RNA en eiwit-kleine organische ligand interacties in cellen.
Een andere veel gebruikte hulpmiddel PPI studeren in een homoloog systeem is de co-immunoprecipitatie (co-IP) test 5. Door een antilichaam tegen een eiwit van belang immunoprecipitatie, co-IP assay kunnen onderzoekers PPI in cellen van verschillende omgevingsomstandigheden en experimentele het oog. Het gebruik van epitoop-gemerkte eiwitten (bijvoorbeeld FLAG, Myc, STREP en HA oa) in affiniteitszuivering (AP) methoden is de isolatie van eiwitten uit complexe eiwitmengsels meerdere downstream assays, zoals Western blot vergemakkelijkt zilverkleuring en enzymatische analyses. Geen van deze eerdere benaderingen maken de isolatie van grote hoeveelheden eiwitcomplexen voor verdere karakterisering zoals in vitro eenssays, ontdekking van regulatorische subeenheden door massaspectrometrie en identificatie van post-translationele modificaties. Een verbeterde versie van de AP methode heet Tandem AP (TAP), een zuiveringstechniek voor het bestuderen PPI door een fusie-eiwit met twee epitopen die wordt gezuiverd door middel van twee opeenvolgende APs 6, 7. In dit artikel presenteren we een variant TAP methode voor het zuiveren van eiwit complexen waarin twee subeenheden worden gelabeld met verschillende epitopen en vervolgens door middel van twee opeenvolgende APs (STREP AP gevolgd door FLAG IP). Eerst geven we een minimalistische overzicht van TAP (figuur 1) en vervolgens een gedetailleerde beschrijving van de experimentele stappen (figuur 2), zodat onderzoekers ze kunnen toepassen op hun eiwitcomplex plaats.
Om de toepasbaarheid van de TAP methode te tonen, kozen we voor een goed gekarakteriseerd cycline-CDK complex (aangeduid als PTEFB kinase), dat uit de regulerende subeenheid cycline T1 (CycT1) en een kinase (CDK9) en is betrokken bij de regulatie van de transcriptie door RNA polymerase II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforyleert het C-terminale domein van Pol II en de bijbehorende negatieve verlengingsfactoren, die transcriptionele pauzeren verlicht de promotor en vergemakkelijkt daardoor transcriptie elongatie 11, 12, 13. Bij deze bekende interactie in het achterhoofd, STREP-tag CycT1 en-FLAG tag CDK9 waren meer dan uitgedrukt in HEK293T cellen. Een wederzijdse TAP experiment werd uitgevoerd met STREP tag CDK9 en FLAG-tag CycT1 verder bevestigen dat het eiwit interactie is onafhankelijk van het gebruikte epitopen. Cellen werden verzameld en gelyseerd 48 uur na transfectie. Het oplosbare lysaat werd gezuiverd door middel van TAP (STREP AP gevolgd door FLAGIK P). Input en gezuiverde eiwitten werden geanalyseerd met western blot en zilverkleuring (Figuur 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven voor de expressie en isolatie van eiwitcomplexen van eukaryote cellen protocol is niet beperkt tot de biochemische eigenschappen van deze moleculaire samenstellingen, maar kan ook worden gebruikt voor de identificatie van nieuwe interactorenen post-translationele modificaties die de functie kan regelen. Het gebruik van affiniteitsmerkers is niet beperkt tot hetgeen vermeld in dit protocol; maar onze ervaring leert dat het gebruik STREP als eerste AP stap verbetert aanzienlijk de opbrengst van het uite…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
Referanslar
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D’Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D’Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D’Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
