Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma
Özet
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
Aktif protein-protein, protein-nükleik asit komplekslerinin saflaştırılması enzimsel faaliyetlerin ve yeni alt birimleri ve post-translasyonel modifikasyonlar de novo tanımlanması karakterizasyonu için çok önemlidir. Bakteriyel sistemlerde bir polipeptidler ve protein kompleksleri çok çeşitli ekspresyon ve saflaştırma için izin verir. Bununla birlikte, bu sistem, post-translasyonel modifikasyonları (örneğin, fosforilasyon ve asetilasyon) içeren protein alt birimlerinin temizleme, ve ökaryotik sisteminde ifade, sadece mevcut olan yeni düzenleyici alt birimlerin / belirlenmesini sağlamaz. Burada, ökaryotik hücrelerden geçici veya stabil ifade epitop etiketli proteinler ile protein komplekslerinin saflaştırılması kolaylaştıran bir roman, sağlam ve streptokok kullanarak verimli tandem yakınlık arıtma (TAP) yöntemiyle ve FLAG-etiketli proteinlerin ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu protokol, Prot karakterize uygulanabilirein karmaşık işlevsellik, kompleks alt birimlerin üzerine post-translasyonel modifikasyonlar keşfetmek ve kütle spektrometresi ile yeni düzenleyici kompleks bileşenleri tanımlamak için. Özellikle, bu TAP yöntemi ve böylece alt deney imkanları geniş bir dizi elde ökaryotik veya patojenik (viral ve bakteriyel) bileşenlerinin oluşturduğu protein kompleksleri çalışma uygulanabilir. Biz protein kompleksleri ile çalışan araştırmacılar, çok farklı şekillerde bu yaklaşımı kullanmak olabilir öneriyoruz.
Introduction
Protein-protein etkileşimleri (PPİ) işlevleri yaklaşık 2 bilgilendirebilir biyolojik süreçler 1, bu PPI üzerinde ileri çalışmalar hassas düzenlenmesi için kritik öneme sahiptir. Çeşitli yaklaşımlar PPI çalışma ve karakterizasyonu için, ayrıca bu yeni düzenleyici protein bileşenlerinin de novo tanımlanması için geliştirilmiştir. 1989 yılında, Stanley Alanlar ve arkadaşları maya iki hibrit (Y2H) tahlil 3 bildirdi. Bu yaklaşım, Saccharomyces cerevisiae 'interactors oranı (yem) tanımlanmış bir protein için (avlayan) tarafsız ve kapsamlı bir tanımlanmasına izin verir. PPIs keşfetmek için dikkate değer yardımcı ek olarak, Y2H deneyi, maya hücrelerinde protein çiftleri karakterize az etkileşim alanları tanımlamak ve bu etkileşimi ortadan kaldırmak başkalaşımların teşhis edilmesi için kullanılabilir. Y2H deneyi değiştirerek, PPIs, aynı zamanda, memeli hücrelerinde incelenebilirclass = "xref"> 4. Y2H tahlilinde (örneğin, maya, üç-hibrid sistemi) varyasyonları da protein-RNA ve hücrelerde protein küçük organik ligand etkileşimlerini incelemek için uygulanabilir.
Homolog bir sistemde PPIs incelemek için bir başka genel olarak kullanılan bir araç ko-immünopresipitasyon (ko-IP) deney 5'tir. ilgili bir proteini immünopresipitasyon bir antikor kullanılarak, CO-IP deney araştırmacılar, çeşitli çevre koşulları ve deneysel durumlarda hücrelere PPI izlemesine izin verir. Epitop etiketli proteinler (örneğin, FLAG, myc, Strep ve HA, diğerleri arasında) afinite temizliği (AP) yöntemleri, batı lekesi de dahil olmak üzere çok sayıda alt-tahliller için kompleks protein karışımları proteinlerin izole edilmesini kolaylaştırmıştır, gümüş leke kullanımı ve enzimatik analizi. Bununla birlikte, bu daha önceki yaklaşımların hiçbiri, in vitro bir de dahil olmak üzere daha ayrıntılı karakterizasyon için protein kompleksleri büyük miktarlarda izole edilmesini sağlamakssays, kütle spektrometresi, ve post-translasyonel modifikasyonlar tanımlanması ile düzenleyici alt birimlerin bulunması. AP yöntemin geliştirilmiş bir versiyonu, iki takip eden AP 6, 7 aracılığıyla saflaştırılır iki epitop bir füzyon proteini oluşturarak PPIs çalışmak için bir saflaştırma tekniğidir Tandem AP (TAP) olarak adlandırılır. Bu makalede, iki alt birimi farklı epitoplar ile etiketlenir ve daha sonra iki ardışık AP (STREP AP FLAG IP elde edilmiş) ile saflaştırılmış edildiği arıtma protein kompleksleri TAP yöntemin bir varyasyonu sunulmuştur. Araştırmacılar kendi ilgi protein kompleksine bunları uygulamak, böylece Biz ilk, TAP minimalist bakış (Şekil 1) ve sonra tüm deneysel adımlar ayrıntılı bir açıklama (Şekil 2) sağlarlar.
TAP yöntemin uygulanabilirliğini göstermek için, (karmaşık, iyi karakterize edilmiş siklin cdk PT şu şekilde de ifade seçtikDüzenleyici alt birim, siklin T1 (CycT1) ve bir kinaz (CDK9) oluşmaktadır, ve RNA polimeraz II (pol II), 8, 9, 10 ile transkripsiyonun düzenlenmesinde görevli EFP kinaz). P-TEFb Pol II ve promoter de transkripsiyon duraklatma hafifletir ilişkili olumsuz uzama faktörleri, C-terminal sahasını fosforilleyen ve böylece transkripsiyon uzama 11, 12, 13 kolaylaştırır. Bu akılda bilinen etkileşim sayesinde, CycT1 STREP-etiketli ve FLAG-etiketli CDK9 HEK293T hücrelerinde ifade üzerindeydi. Bir karşılıklı TAP deney daha protein etkileşim kullanılan epitopların bağımsız olduğunu doğrulamak için STREP etiketli CDK9 ve FLAG-etiketli CycT1 ile gerçekleştirildi. Hücreler toplandı ve 48 saat sonra transfeksiyon parçalanmıştır. Çözünür lizat TAP ile saflaştırılmıştır (STREP AP FLAG ardındanIP). Giriş ve saflaştırılmış proteinler Western blot ve gümüş leke (Şekil 3) ile analiz edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İfade ve ökaryotik hücrelerde protein komplekslerinin izolasyonu için açıklanan protokol, moleküler düzeneklerinin biyokimyasal karakterizasyonu ile sınırlı değildir, aynı zamanda işlevini düzenleyen olabilir yeni interactors ve post-translasyonel modifikasyonlar tanımlanması için de kullanılabilir. afinite etiketleri kullanımı Bu protokolde belirtilen ne ile sınırlı değildir; ancak deneyimi ilk AP adım olarak Strep kullanımı ile önemli ölçüde nihai protein-protein kompleksinin verimi art…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
Referanslar
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D’Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D’Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D’Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
