Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche
Özet
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
La purificazione della proteina-proteina attiva e complessi acido nucleico-proteina è cruciale per la caratterizzazione delle attività enzimatiche e de novo identificazione di nuovi subunità e modificazioni post-traduzionali. sistemi batterici permettono l'espressione e la purificazione di una grande varietà di singoli polipeptidi e proteine complessi. Tuttavia, questo sistema non consente la purificazione di subunità proteiche che contengono modificazioni post-traduzionali (ad esempio, fosforilazione e acetilazione), e l'identificazione di nuovi subunità regolatorie che sono presenti solo / espressi nel sistema eucariotico. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un romanzo, robusto, ed efficiente metodo di purificazione tandem affinità (TAP) utilizzando STREP- e le proteine FLAG-tag che facilita la purificazione di complessi proteici con transitoriamente o stabilmente espresso proteine epitopi-tag da cellule eucariotiche. Questo protocollo può essere applicata per caratterizzare protEin funzionalità complesse, alla scoperta di modificazioni post-traduzionali su subunità complesse, e per identificare nuovi componenti complessi normativi mediante spettrometria di massa. In particolare, questo metodo TAP può essere applicato per studiare complessi proteici formati da componenti eucariotiche o patogeni (virali e batteriche), ottenendo così una vasta gamma di possibilità sperimentali valle. Proponiamo che i ricercatori che lavorano con i complessi proteici potrebbero utilizzare questo approccio in molti modi diversi.
Introduction
Interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la precisa regolazione dei processi biologici 1, e ulteriori studi su questi inibitori della pompa protonica può dare informazioni relative la loro funzione 2. Diversi approcci sono stati ideati per lo studio e la caratterizzazione di IPP e per l'identificazione de novo di nuove componenti proteici normativi. Nel 1989, Stanley Campi e colleghi hanno riportato il lievito doppio ibrido (Y2H) test 3. Questo approccio consente l'identificazione imparziale e completa di interattori (prede) per una proteina definito di interesse (esche) in Saccharomyces cerevisiae. Oltre alla sua notevole utilità per scoprire IPP, il saggio Y2H può essere utilizzato per caratterizzare coppie di proteine in cellule di lievito, definendo domini interagenti minime, e identificare mutazioni che aboliscono tali interazioni. Modificando il test Y2H, inibitori della pompa protonica può anche essere studiata in cellule di mammiferoclass = "xref"> 4. Variazioni del dosaggio Y2H (ad esempio, il sistema di lievito tre ibrido) possono essere applicate anche a studiare proteina-RNA e proteina-piccola interazioni legante organico nelle cellule.
Un altro strumento comunemente utilizzato per studiare PPI in un sistema omologo è il test 5 co-immunoprecipitazione (co-IP). Utilizzando un anticorpo per immunoprecipitare una proteina di interesse, il test di co-IP permette ai ricercatori di monitorare PPI nelle celle per diverse condizioni ambientali e situazioni sperimentali. L'uso di proteine epitopi-tag (ad esempio, la bandiera, Myc, STREP, e HA, tra gli altri) in purificazione di affinità (AP) metodi ha facilitato l'isolamento di proteine da miscele complesse di proteine per diversi saggi a valle, tra cui Western Blot, macchia d'argento , e l'analisi enzimatica. Tuttavia, nessuno di questi approcci precedenti consentire l'isolamento di grandi quantità di complessi proteici per un'ulteriore caratterizzazione compreso in vitro unssays, scoperta di subunità regolatorie mediante spettrometria di massa, e l'identificazione di modificazioni post-traslazionali. Una versione migliorata del metodo AP viene chiamato Tandem AP (TAP), che è una tecnica di purificazione per studiare IPP creando una proteina di fusione con due epitopi che viene purificato mediante due AP successive 6, 7. In questo articolo, vi presentiamo una variante del metodo TAP per purificare complessi proteici in cui due subunità sono contrassegnati con diversi epitopi e poi purificato attraverso due punti di accesso sequenziali (STREP AP seguiti da FLAG IP). In primo luogo abbiamo a disposizione una panoramica minimalista di TAP (figura 1) e poi una descrizione dettagliata di tutte le fasi sperimentali (figura 2), in modo che i ricercatori li possono applicare alla loro complesso proteina di interesse.
Per dimostrare l'applicabilità del metodo di TAP, abbiamo scelto un ben caratterizzato ciclina-CDK complesso (di seguito PTEFB chinasi), che è composto della ciclina T1 subunità regolatrice (CycT1) e una chinasi (CDK9), ed è coinvolto nella regolazione della trascrizione di RNA polimerasi II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila il dominio C-terminale di Pol II e dei suoi fattori di allungamento negativi associati, che allevia la pausa trascrizionale al promotore e facilita in tal modo la trascrizione allungamento 11, 12, 13. Con questa interazione conosciuta in mente, STREP-tag CycT1 e CDK9 FLAG-tag sono stati oltre espresso in cellule HEK293T. Un esperimento TAP reciproca è stata eseguita con CDK9 STREP-tag e FLAG-tagged CycT1 per convalidare ulteriormente che l'interazione proteina è indipendente dalle epitopi utilizzati. Le cellule sono state raccolte e lisate 48 ore dopo la trasfezione. Il lisato solubile è stato purificato dalla TAP (STREP AP seguito da FLAGIP). Input e proteine purificate sono state analizzate mediante western blot e macchia d'argento (Figura 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto per l'espressione e l'isolamento di complessi proteici da cellule eucariotiche non è limitata alla caratterizzazione biochimica di tali complessi molecolari, ma può anche essere utilizzato per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che potrebbe regolare la loro funzione. L'utilizzo di tag di affinità non si limita a ciò che è menzionato in questo protocollo; ma la nostra esperienza suggerisce che l'utilizzo STREP come primo passo AP m…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
Referanslar
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