从真核细胞蛋白质复合体串联亲和纯化

蛋白质-蛋白质相互作用（质子泵抑制剂）是用于生物过程^1，并在这些质子泵抑制剂进一步研究的精确调节临界可以告知他们的功能^2。几种方法已被设计用于质子泵抑制剂的研究和表征以及用于新的调控蛋白组分的从头鉴定。 1989年，斯坦利领域和同事报道酵母双杂交（Y2H）检测^3。这种方法允许在酿酒酵母作用因子（猎物）的定义的兴趣（诱饵）蛋白的公正和全面的鉴定。除了其用于发现质子泵抑制剂显着的效用，在Y2H测定可用于在酵母细胞中表征蛋白质对，限定最小相互作用域，以及识别废除这种相互作用的突变。通过修改Y2H测定中，质子泵抑制剂，也可在哺乳动物细胞中研究了类=“外部参照”> 4。在Y2H测定（ 如酵母三杂交系统）的变型也可以用于研究蛋白质的RNA，并在细胞中的蛋白质，小的有机配体的相互作用。

另一种常用的工具来研究质子泵抑制剂以同源系统是共免疫沉淀（共-IP）测定^5。通过使用抗体免疫沉淀目的蛋白质，共同的IP测定使研究人员能够监测细胞对各种环境条件和实验条件质子泵抑制剂。使用表位标记的蛋白（ 例如 ，FLAG，Myc基因，STREP和HA，等等）在亲和纯化（AP）的方法，促进了从复合蛋白质混合物为几个下游测定法，包括免疫印迹蛋白质的分离，银染色的和酶分析。然而，这些以前的方法使能大量的蛋白质复合物的用于进一步表征，包括在体外在隔离ssays，通过质谱法，和翻译后修饰的识别调节亚基的发现。该AP方法的改进版本被称为串联的AP（TAP），这是通过创建与通过两个连续的AP ^6,7纯化两个表位的融合蛋白研究质子泵抑制剂的纯化技术。在这篇文章中，我们提出了净化蛋白复合物，其中两个亚单位的标签与不同的表位，然后通过两个连续的AP（STREP AP随后FLAG IP）纯化TAP方法的变型。我们首先提供的TAP的一个简约概述（ 图1），然后所有的试验步骤的详细描述（ 图2），使得研究人员可以将它们应用到他们感兴趣的蛋白复合物。

为了证明在TAP方法的适用性，我们选择了一个良好表征细胞周期CDK络合物（简称PTEFB激酶），它是由所述调节亚基细胞周期蛋白T1（CycT1）和激酶（CDK9）的，并且是由RNA聚合酶II（RNA聚合酶^{II）8，9，10}参与转录的调节。 P-TEFB磷酸聚合酶II和其相关联的消极延伸因子，这在启动子减轻转录暂停的C-末端结构域，并由此促进转录延伸^{11，12，13。}考虑到这一众所周知的互动，STREP标记CycT1和FLAG标记CDK9均超过在HEK293T细胞中表达。互惠TAP实验与STREP标记CDK9和FLAG标记CycT1进行进一步验证该蛋白质相互作用是独立使用的表位。收集细胞并裂解48小时后转染。 （AP STREP之后FLAG的可溶性裂解液纯化TAPIP）。输入和纯化蛋白通过Western印迹和银染色（ 图3）分析。