Rapid Kwantificering van Mitogen geïnduceerde blastogenesereactie in T-lymfocyten voor het vaststellen van Immuunmodulerende Drugs

Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Wright State University Lab Animal Care en gebruik Comite en Institutional Review Board goedgekeurd uitgevoerd. OPMERKING: Menselijke PBMC's worden geïsoleerd door Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie methode 5. 1. Spleen Harvest Huis volwassen vrouwelijke ICR-muizen in standaard laboratoriumomstandigheden met voedsel, water en beddengoed specifiek voor de soort vereisten. OPMERKING: dieren hadden een gemiddelde leeftijd van 2,9 maanden en een gemiddeld gewicht van 30,4 g op het tijdstip van de euthanasie. Op de datum van isolatie (DOI), euthanaseren van de dieren individueel zonder andere soortgenoten aanwezige dieren. Alles in het werk om een ​​minimale belasting ervoor te zorgen dat de muis. Euthanaseren het gebruik van CO 2 met secundaire breken van de nek tot de dood te verzekeren. Plaats het dier nog in de overdracht kooi, in de CO 2 kamer en start de gasstroom bij 5 l / min. Deze stroomsnelheid verdringt zuurstof bij de aanbevolen 10-30% per min. Nadat het dier bewusteloos is, verhoging van de CO 2 debiet tot 15 l / min. Controleer het dier ademstilstand en laten in de kamer gedurende nog 2 min. Solliciteer cervicale dislocatie met afleiding kracht om de dood te verzekeren. Oogst de milt van het dier met behulp van aseptische techniek binnen 10 minuten van de dood. Steriliseren twee reeksen schaar en forceps voor het verwijderen van de milt in een autoclaaf oven voor gebruik. Steriliseer de dissectie oppervlak door toepassing 70% ethanol. Toepassen 70% ethanol om de muis buik. Met behulp van een set van de schaar en pincet, maak een snede in de vacht en de huid van de linker kant van de buik, en trek uit elkaar en schil de rug van de huid om het buikvlies te onthullen. Eenmaal blootgesteld, gelden 4% chloorhexidine-oplossing voor het openen van het buikvlies. Met behulp van de tweede set van scissors en pincet, maak een 2 tot 3 cm gesneden langs de centrale buik. Open het buikvlies en verwijder de milt door het wegsnijden van viscerale bijlagen en overtollig vet. Plaats de milt in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). 2. Voorbereiding van de Raw Splenocyten OPMERKING: Voer alle stappen onder een laminaire stroming bioveiligheid kast met behulp van aseptische techniek. Week de geoogste milten in 10 ml gedeïoniseerd steriel H 2 O 5 min in een 10 cm kweekschaal tot het oppervlak erytrocyten te lyseren. OPMERKING: Deze stap kan worden overgeslagen als de milt tijdens isolement werd beschadigd. Om de splenocyten los, verpletteren de milt tussen twee gesteriliseerde glasplaatjes (matte kant van de milt) over een nieuwe 10 cm cultuur schotel. Mengen met 10 ml RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 50 IU / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine (hierna genoemd eens compleet RPMI). Filter de cellen door een steriele 40 um nylon cel zeef in een nieuwe 10 cm cultuur schotel op het bindweefsel en vuil te verwijderen. Lyse de resterende erythrocyten door toevoeging van 20 ml RBC lysisbuffer bestaande uit 155 mM NH4CI, 10 mM NaHCO 3 en 0,1 mM EDTA bij pH 7,4 en ~ 300 mOsm / L. OPMERKING: osmolaliteit gemeten met een vriespunt of dampdrukosmometer. Breng de cellen van de 10-cm plaat een 50 ml conische buis en centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min (4 ° C). Verwijder het supernatant, voeg 20 ml RBC lysis buffer en resuspendeer de gepelleteerde cellen door pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur in lysisbuffer gedurende 10 minuten onder voorzichtig schommelen. Centrifugeer gedurende 10 min bij 250 xg (4 ° C) om de cellen te pelleteren. Giet het lysisbuffer. Resuspendeer cellen in 10 ml compleet RPMI en centrifugeer weer (250 x g, 10 min, 4 ° C). SchijfArd de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de splenocyten in 2 ml compleet RPMI verwarmd tot 37 ° C voor overdracht naar de kolom nylon wol vezels. 3. Zuivering van T lymfocyten Was de nylonwol kolommen tweemaal met 5 ml compleet RPMI. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2 celkweek incubator gedurende 1 uur. Opmerking: Het is noodzakelijk om de nylon wol nat gedurende de duur van het experiment te houden en te gebruiken volledig RPMI verwarmd tot 37 ° C voor nylon wol isolatiestappen. Voeg geïsoleerde splenocyten aan de kolom en incubeer gedurende 1 uur om de B-cellen, fibroblasten en hulpcellen te houden aan de nylon wol. Voeg 2 ml RPMI dat de splenocyten in de kolom en passeren tot de bovenkant van de nylon wol wordt bereikt. Voeg 2 ml compleet RPMI verwarmd tot 37 ° C boven de nylon wol en passeren het medium door de woltotdat het vloeistofniveau bereikt het bovenoppervlak. Voeg 3 ml warm compleet RPMI de kolom volledig te bedekken de nylon wol. Incubeer de gevulde kolom ongestoord in een 37 ° C, 5% CO 2 celkweek incubator gedurende 1 uur. Elueer de cellen door wassen van de kolom tweemaal met 5 ml compleet RPMI. Voer een aanvullend wassen van de geëlueerde cellen door centrifugatie. Vul de kolom boven 2 maal met compleet RPMI en laat de oplossing in de kolom te laten stromen in een 50 ml steriele conische buis. LET OP: Vermijd te tikken of stoten de kolom, die de B-cellen, accessoire cellen en fibroblasten die vastzit aan de nylon wol kunnen verjagen. Verzamel de doorstroomfractie en centrifugeren bij 250 g gedurende 10 minuten (4 ° C) om de cellen te pelleteren. Was eenmaal met 10 ml compleet RPMI. Pellet de cellen opnieuw (250 x g, 10 min, 4 ° C) en resuspendeer in 2 ml compleet RPMI. Meet de c ell dichtheid met behulp van een hemocytometer en verdund in volledige RPMI tot 0,5 x 10 6 cellen / ml. Seed 1 of 2 ml aliquots van de cellen in elk putje van een 24- of 6-well celcultuur plaat, respectievelijk, en de cellen te kweken bij 37 ° C met 5% CO2. Opmerking: 1 mM 1,4-dithiothreitol (DTT) kunnen aan elk putje worden toegevoegd in dit stadium T-celoverleving verbeteren. Optioneel: Bevestig de efficiëntie van de isolatie protocol met flowcytometrie. Dit protocol levert normaal ~ 80% T-lymfocyten 23. LET OP: Nylon-wol gezuiverde cellen bevatten ongeveer 50% CD4 + en 23% CD8 + cellen. Het verder zuiveren van de CD4 + en CD8 + subpopulaties, kan een immunomagnetische depletie stap worden uitgevoerd met behulp van acht antilichamen en magnetische korrels 24. Alternatief kan zuiverder CD4 + en CD8 + T-celpopulaties worden geïsoleerd door positieve of negatieve selectie met specifieke antilichamen. _title "> 4. Activering van T-lymfocyten en experimentele Drug Exposure Activeren van T-lymfocyten binnen 24 uur van isolatie door de toevoeging van PMA en ionomycine calciumzout of magnetische bolletjes gecoat met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen 23,25,26. Voeg experimentele geneesmiddelen (bijvoorbeeld CsA, FK506, rapamycine, tram 34 en FTY720) op het moment van activering. OPMERKING: Hier PMA varieerden 2-250 ng / ml en de concentratie ionomycine werd bij 250 nM gehouden. Indien mogelijk moet verdunningen worden bereid uit voorraad hoeveelheden van elk geneesmiddel, zodat het volume toegevoegd aan elk putje van cellen ≥1 pl reproduceerbaarheid te garanderen. Het anti-CD3 / anti-CD28-beklede magnetische parels worden toegevoegd in een 1: 1 korrel tot cel verhouding. Verhoging van het aantal korrels per cel (dat wil zeggen, de korrel tot cel verhouding) zal de intensiteit van de stimulatie 25,26 verhogen. De korrels worden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in volledig RPMI voordat de toevoeging aan de cellen. Merk op dat trypanblauw kleurt de kralen. Kweken van de cellen gedurende 12-72 uur bij 37 ° C met 5% CO 2 voor het analyseren van de geautomatiseerde celteller. 5. Automated Cell Collection Tellergegevens Voordat u het monster, zorg ervoor dat de cellen voorzichtig worden gemengd met een serologische pipet om klonten te voorkomen. Dit is vooral belangrijk voor geactiveerde lymfocyten vanwege hun kleverigheid. Voor kweken die geactiveerd met anti-CD3 / CD28 beads na pipetteren, overbrengen van het monster naar een 1,5 ml of 2 ml centrifugebuis. Scheid de kralen door het houden van de buis op een magneet voor 1-2 minuten. Gebruik het supernatant dat de cellen voor analyse. OPMERKING: Analyseer zowel rustende en geactiveerde cellen binnen 1 uur om eventuele pre-activering van rustende cellen door serum aanwezig in het kweekmedium. Na 12 uur PMA / ionomycine stimulatie, een kleine toename in celgrootte werd gedetecteerd (Figuur 2 </strong>). Bij 72 uur, geen significante celgrootte stijging ten opzichte van 48 uur werd waargenomen (gegevens niet getoond). Breng 1 ml van de celsuspensie in een monsterhouder en voer het door de geautomatiseerde celteller volgens de instructies in de handleiding. Opmerking: Voor elk van de proeven dient minimaal 1 ml (maximaal 2 ml) van de celkweek gebruikt worden. De geautomatiseerde celgetalmeter gebruikt een spuit trypan blauw mengen met de celsuspensie en geeft de mobiele trypan blue mengsel over een gebied dat wordt afgebeeld en geanalyseerd door de software. De software detecteert trypan blue-gekleurde cellen, tekent een cirkel rond elke cel, en bepaalt de diameter. 100 foto's worden verzameld uit elk monster, en de levensvatbaarheid van de cellen en maten worden bepaald. De drempelwaarde van de celtelinrichting hier gebruikt heeft een ondergrens van 5 urn. Gegevensoverdracht van elke rit naar een spreadsheet voor verdere analyse. Kalibreer het apparaat regelmatig met een 1ml monster van 6 urn en 8 urn diameter polystyreen korrels. OPMERKING: De feitelijke korrelgroottes gemeten door de fabrikant voor elke partij te gebruiken, niet de nominale maat. 6 en 8 urn kralen zijn handig omdat deze diameters dicht bij de verwachte diameters van rustende en geactiveerde T-cellen (zie figuur 1). 6. gegevens en statistische analyse Analyseer de gegevens met behulp van geschikte statistische en grafische software. LET OP: De spreadsheet voor elke run bevat het aantal cellen met elk een diameter (bereik: 5 pm tot 70 pm). De cellen boven een 17 urn diameter verwijderd uit de analyse stofdeeltjes en kleine bellen, dat kan worden gelezen als levensvatbare cellen door het instrument te sluiten. Voer hypothese te testen met behulp van Welch t-test voor data sets met ongelijke variantie; Resultaten worden als statistisch significant als p <0,001. De formule werd gebruikt, <img alt = "Vergelijking 1" src = "/ files / ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg" /> waar en zijn voorbeelden van middelen, en zijn steekproefvarianties, en en zijn steekproefomvang voor elke dataset. Het aantal vrijheidsgraden wordt conservatief geschat met behulp van de kleinste van de twee steekproefomvang voor elke vergelijking. Staafgrafieken worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. 7. milt T-lymfocyt proliferatie assay Meet T-celproliferatie met een MTS- of MTT-gebaseerde colorimetrische plaatlezer proliferatietest. OPMERKING: De test is basisd MTS tetrazolium verbinding (Owen's reagens) reductie oplosbare formazanproduct, waarschijnlijk door NADPH of NADH geproduceerd in metabolisch actieve cellen door dehydrogenase-enzymen. Aantal gezuiverde T-cellen met een hemocytometer en resuspendeer ze in volledig RPMI-1640 in een uiteindelijke dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml. Opmerking: 1 mM DTT kan worden toegevoegd aan de cellen in dit stadium. Activeer de cellen met PMA en ionomycine met testgeneesmiddelen, indien nodig en meng voorzichtig (zoals in stap 4). Plaat 100 ul van de cellen in elke well van een 96-well celcultuur behandeld plaat en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 48 uur. Voeg 100 ul RPMI-1640 medium zonder cellen in een putje van een lezing van de achtergrondabsorptie te verkrijgen. Voeg 20 pl MTS gebaseerde reagens aan elk putje en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4 uur. Neem absorptiemetingen bij 490 nm met behulp van een plaat lezer. De Absorbance metingen overeenkomen met het aantal metabolisch actieve cellen in elk putje. OPMERKING: Trek achtergrond niveaus indien nodig. De achtergrondabsorptie zijn afhankelijk van het type kweekmedium, serum, externe pH en duur van MTS reagens blootstelling aan licht. MTS-gebaseerde reagentia zijn lichtgevoelig en blootstelling aan licht gedurende enkele uren kan resulteren in hogere absorptiewaarden achtergrond.