Desenvolvimento de um sistema de entrega de DNA Economical por "Acufection" e sua aplicação à Skin Research

A pele é a primeira linha de defesa do hospedeiro. Os queratinócitos (KCs) são o tipo de célula principal na pele de seres humanos e ratinhos. Em resposta a estímulos ambientais (por exemplo, luz solar, oxigénio, produtos químicos e invasão patogénico), KCs são activados e produzir uma vasta gama de citocinas prinflamatias e quimiocinas, tais como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α e GM-CSF ^1. Juntos, desencadear o recrutamento de células do sistema imunológico para a pele. Inflamação cutânea agravada é muitas vezes associada com numerosas doenças humanas, incluindo a dermatite de contacto ectópico aguda e inflamação mediada por células T crónica (por exemplo, dermatite de contacto alérgica e psoríase) ^2. Modular as respostas pró-inflamatórias da pele através da inibição da activação KC é uma abordagem aceitável para tratar a inflamação cutânea. Este protocolo descreve uma nova abordagem para expressar transitoriamente um gene de citoquina na epiderme, a fim de estudar res imunesponse como consequência de um tal tratamento na pele.

A epiderme compõe a camada mais superficial da pele. Ele serve como uma barreira física manter as substâncias externas, tais como os ácidos nucleicos e os agentes patogénicos de entrar nas camadas mais profundas da pele. Várias técnicas sem agulha foram estabelecidas para a transferência de ADN epidérmico ^{3, 4.} ADN em solução ou associado com lipossomas catiónicos ou vectores de adenovus foi directamente aplicado à epiderme modificados com técnicas tais como a remoção do estrato córneo ou para o tratamento com depilating reagente. A remoção do epitélio córneo facilita ADN de atravessar a barreira epidérmica e interacção com queratinócitos e células de Langerhans para induzir respostas imunes ^5. Enquanto uma grande área de superfície está disponível para transferência de DNA e esta abordagem não envolve agulhas, há desvantagens, incluindo a exigênciapara as grandes quantidades de ADN (10 – 100), o tratamento dura sobre a pele por decapagem e os resultados inconsistentes na indução da resposta imunitária nos animais imunizados, sem reforço de entrega de ADN ^6. Entrega intracelular mediada por micropartícula de ADN nu para a pele tem sido mostrado para ser altamente eficiente e reprodutível para a indução de resposta imune ^{7, 8.} Uma pistola de genes de mão tem sido usado para bombardear o local alvo da pele com partículas de ouro revestidas com ADN de plasmídeo de 2 um de diâmetro em tamanho por meio de hélio pressurizado fluxo de ar ^9. O DNA de plasmídeo é presumivelmente absorvidos pelas células dendríticas (DC) KCsand na pele e a proteína é expressa localmente ou ser transportado para nódulos linfáticos de drenagem por DCs ^10. Embora o sistema arma gene é simples e requer experiência técnica limitada, o custo para a preparação e entrega dos "bul DNAlet "(isto é, pós de ouro, de gás hélio) e para a pistola de genes em si tem limitado a sua aplicação geral. Além disso, o requisito de um sistema de fornecimento de gás hélio limita a facilidade de transporte pistola de genes quando as experiências são realizadas em locais diferentes. microdispersão demonstrou-se conseguir uma maior eficiência de transferência de genes que única injecção e bombardeamento de partículas ^11. microdispersão utiliza uma pistola de tatuagem para entregar ADN para a pele sem o uso de grânulos de partículas ^11. oscilante as microagulhas na pele utilizando esta abordagem é provável raspar directamente a membrana celular e assim transferir DNA para várias células, ao mesmo tempo. no entanto, a dor associada com o grande número de injecções com agulhas 0,254 mm de diâmetro é uma desvantagem.

Aqui nós fornecemos uma abordagem alternativa para a entrega de ADN in vivo. O "acufection" </strong> protocolo que descrito aqui oferece uma maneira económica e eficaz para entregar o ADN de plasmídeo na pele do rato. Resumidamente, dez agulhas de acupunctura (0,2 mm de diâmetro x 13 mm de comprimento) foram ligados em conjunto por uma fita adesiva. Um volume de 10? L de PBS com 10 ug de ADN de plasmídeo contendo o transgene de interesse foi colocado sobre a pele tratada com creme de barba, creme depilatório flanco. Utilizando o feixe de agulhas de acupuntura para oscilar a superfície (1 cm x 1 cm) da pele, as queratinas na camada córnea foram soltos e o DNA de plasmídeo aplicada à superfície foi absorvido para dentro da epiderme. os danos da pele foi monitorado e encontrado para ser mínima. A expressão do gene transfectado na pele acufected foi confirmada por tanto quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) e ELISA. Os efeitos imunomoduladores dos entregue-acufection IL-15ΔE7 na inflamação cutânea foram demonstrada utilizando o modelo de ratinho tratado com IMQ ^12. Enquanto acufection prova ser um dema fácil e menosnding método para entrega de ADN in vivo, a quantidade óptima de ADN para genes diferentes e os tempos para picar a pele tem que ser cuidadosamente optimizadas para obter resultados reprodutíveis.