Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em> Drosophila melanogaster</em> Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

De modulatie van synaptische functie draagt ​​bij aan de opmerkelijke vermogen van het zenuwstelsel om exact te voldoen of aanpassen aan veranderende milieu stimuli. Aanpassing van de presynaptische afgifte vesicle kans is een manier van het controleren synaptische sterkte ^1. Synaptische vesikel afgifte vindt plaats op de actieve zone (AZ), een gespecialiseerde gebied van het presynaptische membraan ^2. AZ wordt gekenmerkt door een cassette van specifieke eiwitten ^{3, 4.} Meeste eiwitten dragen aan AZ samenstel zijn sterk geconserveerd in nematoden, insecten en zoogdieren ^5. Recente studies suggereren dat het niveau van neuronale activiteit regelt de moleculaire samenstelling van de AZ, die op zijn beurt bijdraagt aan de regeling van de functionele geven zowel in vitro als in vivo ^{6, 7,}> 8. We eerder geconstateerd dat fotoreceptor AZS ondergaan moleculaire remodeling in Drosophila na langdurige blootstelling aan natuurlijke omgevingslicht ^9. In deze toestand hebben we vastgesteld dat het aantal Bruchpilot (Brp) -positieve AZS werd gereduceerd in de fotoreceptor axonen.

De Brp / CAST / ELKS familie eiwitten zijn fundamentele bouwstenen van AZS in gewervelde en ongewervelde synapsen ^10. In Drosophila brp mutanten, opgeroepen blaasje release onderdrukt ^{11, 12.} De 17 C-eindstandige aminozuurresten van Brp essentieel zijn voor synaptische blaasjes clustering in de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) ^{13, 14.} Deze studies toonden de centrale rol van dit molecuul in AZ inrichting en functie. Met een recent ontwikkelde genetische tool, Synaptic Tagging met Recombinatie (STAR), Brpkan worden waargenomen in vivo in specifieke celtypen, endogene expressieniveaus en één synaps resolutie ^15. Dit instrument maakt het mogelijk om de endogene dynamiek van synapsen kwantitatief in het complex centrale zenuwstelsel evalueren.

Er zijn verschillende studies waaronder synaps kwantificering gebaseerd op gegevens verkregen van confocale microscopie geweest. Synaptische veranderingen werden geëvalueerd door meting van de lengte, het gebied, het volume, de dichtheid en het tellen op basis van geavanceerde softwaretoepassingen. Bijvoorbeeld, de freeware ImageJ biedt een kwantificering methode voor het totale synaptische gebied en synaptische dichtheid maatregelen op de Drosophila NMJ ^16. Het aantal colocalization plaatsen van pre-en postsynaptische markers zijn gekwantificeerd met behulp van de plugin "Puncta Analyzer" beschikbaar op de ImageJ software platform ^17. Als alternatief, een multi-paradigm numerieke computeromgeving gebaseerde programma Synapse Detector (synd), automatisch traceren dendrieten van neuronen gelabeld met een fluorescerende marker, en kwantificeert de synaptische eiwitniveaus als functie van de afstand van het cellichaam ^18. De software Synaptic Puncta Analyse (SynPAnal), is ontworpen voor de snelle analyse van 2D-beelden van neuronen verkregen uit of confocale fluorescentiemicroscopie. De primaire functie van deze software is de automatische en snelle kwantificering van dichtheid en intensiteit van eiwitten puncta ^19. Recent is een automatisch leren die synaps algoritme gegenereerd voor kwantificering van synaptische aantal 3D ^20, gebruik te maken van de 3D-visualisatie Assisted Analysis (Vaa3D) software ^21.

image commerciële analyse software zijn ook krachtige tools voor het synaptische kwantificeringen. Bijvoorbeeld, de fluorescentiegelabelde neurotransmitter receptoren of presynaptische AZ component zijn gekwantificeerd in drie dimensies met één synaps resolutie in C. elegans ²² of Drosophila olfactorisch systeem ^{23, 24,} waardoor honderden synapsen snel te karakteriseren binnen een enkel monster.

Hier presenteren we een methode een aangepaste beeldanalyse software plug-in uitgevoerd in een multi-paradigma numerieke computeromgeving die toestaat om semi-automatisch verschillende aspecten van AZS, met inbegrip van hun aantal, de locatie en het niveau van verrijking van moleculaire componenten te analyseren het AZ. Aldus is deze complexe analyse konden we de dynamiek van synaptische bestanddelen in axon terminals onder verschillende omgevingsomstandigheden evalueren. Wij onderzochten het effect van blootstelling aan licht op de output synapsen van de volwassen vlieg fotoreceptoren. De procedure wordt uitgevoerd in drie stappen: 1)voorbereiding op blootstelling aan licht, 2) dissectie, immunohistochemie en confocale beeldvorming, en 3) beeldanalyse.