Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

replicazione del DNA Mammalian è strettamente regolata per assicurare la replica esatta di ciascun cromosoma esattamente una volta durante il ciclo cellulare. La replica avviene secondo un ordine altamente regolamentato – più grandi regioni genomiche (~ Mb) replicano all'inizio della fase S (inizio replicare i domini), mentre altre regioni genomiche replicano dopo a (domini media e tarda replicanti) medio o tarda fase S ^1. La maggior parte del genoma replicati contemporaneamente in tutti i tessuti (domini ToR costitutive), mentre il 30% – 50% del genoma, cambia ToR tra tessuti ^2, durante la differenziazione ^{3, 4} e, in misura minore, anche durante trasformazione di cancro ⁵ . Inoltre, alcune regioni genomiche replicano asincrono ^{6, 7, 8,} cioè vi è una differenzanel capitolato tra i due alleli.

ToR correla con molte caratteristiche genomiche e epigenomiche compresi i livelli di trascrizione, contenuto GC, lo stato della cromatina, la densità genica, ecc ^{1, 9.} TR è anche associato con tassi di mutazione e tipi ^{10, 11} e quindi non sorprende, perturbazioni del programma di replica sono collegati al cancro ^{12, 13.} La relazione causale tra Tor e la struttura della cromatina non è ancora capito. E 'possibile che aperto cromatina facilita replica presto. Tuttavia, un modello alternativo suggerisce che la cromatina è assemblato durante la replica e le diverse autorità di regolamentazione cromatina presenti all'inizio e alla fine di piombo fase S al differenziale confezionamento delle regioni replicanti precoce e tardiva ^{1, 14} </sup>. Abbiamo recentemente dimostrato che i TR modella il contenuto di GC influenzando il tipo di mutazioni che si verificano in diverse regioni genomiche ^11.

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è il metodo principale per la misurazione ToR a loci individuale. Si esegue semplicemente contando la percentuale di cellule in fase S che presentano segnali FISH singoli contro la percentuale di doppietti per un dato allele ^{15, 16.} Un metodo alternativo, costituito da impulsi etichettatura del DNA con BrdU, l'ordinamento delle cellule in base al loro contenuto di DNA a più punti di tempo lungo S, immunoprecipitating DNA contenente BrdU, e controllando l'abbondanza di DNA precipitato con qPCR ^17.

mappatura ToR genomico può essere raggiunto in due modi. Il primo metodo è una versione genomico del metodo basato BrdU-IP sopra descritta, in cui la quantificazione della quantitàdi DNA precipitato in ogni frazione viene effettuata contemporaneamente per l'intero genoma mediante ibridazione di microarray o sequenziamento. Il secondo metodo, CNR-TOR, si basa sulla misurazione il numero di copie di ciascuna regione genomica delle cellule in fase S e normalizzazione dal contenuto di DNA nelle cellule G1. In questo metodo, le cellule sono ordinati per FACS in non-replicante (fase G1) e replicare (fase S) gruppi (Figura 1). Le cellule in G1 hanno lo stesso numero di copie in tutte le regioni genomiche e quindi il loro contenuto di DNA dovrebbero essere gli stessi. D'altra parte, il numero di copie di DNA in S dipende TR, poiché le regioni replicanti primi sottoposti replicazione in maggior parte delle cellule e quindi il loro contenuto di DNA è raddoppiata, considerando che le regioni tardive replicanti non hanno ancora replicato in maggior parte delle cellule e quindi il loro contenuto di DNA sarà essere simile a quello delle cellule G1. Quindi il rapporto S G1 del contenuto di DNA è indicativa dei TR. La quantità di DNA per ciascuna regione genomica è misurata mediante ibridazionemicroarrays o dal sequenziamento profondo ^{2, 8.} I vantaggi del metodo CNR-TR saranno ulteriormente discussi.

Questo documento descrive il metodo CNR-TOR per la mappatura genomica TR come descritto nella Figura 2. L'articolo discute i piccoli dettagli di tutto il processo dalla raccolta delle cellule fino a quando l'analisi di base dei risultati e la creazione di mappe genomiche Tor. Il protocollo descritto in questo documento è stata eseguita con successo su vari tipi di cellule in coltura. Futuri miglioramenti di questo protocollo può portare alla mappatura del capitolato in vivo e in tipi di cellule rare.