Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Zoogdier DNA replicatie strak geregeld om de juiste replicatie van elk chromosoom precies één keer te verzekeren tijdens de celcyclus. Replicatie gebeurt op basis van een sterk gereguleerde order – meerdere grote genomische regio's (~ Mb) te herhalen aan het begin van de S-fase (begin repliceren domeinen), terwijl andere genomische regio's later bootsen midden of late S-fase (midden en late replicerende domeinen) ^1. De meeste genoom repliceert tegelijk in alle weefsels (constitutieve ToR domeinen), terwijl 30% – 50% van het genoom verandert ToR tussen weefsels ^2, tijdens differentiatie ^{3, 4} en in mindere mate ook bij kanker transformatie ⁵ . Bovendien bepaalde genoomgebieden repliceren asynchroon ^{6, 7, 8,} namelijk er is een verschilin de ToR tussen de twee allelen.

ToR correleert met vele genomische en epigenomisch functies, waaronder transcriptie niveaus, GC-gehalte, chromatine staat, gen dichtheid, enz. ^{1, 9.} ToR wordt ook geassocieerd met mutatie tarieven en types ^{10, 11} en daarom niet verwonderlijk, worden verstoringen van de replicatie-programma verband gebracht met kanker ^{12, 13.} Het causale verband tussen de taakomschrijving en chromatine structuur is nog niet begrepen. Het is mogelijk dat geopend chromatine vergemakkelijkt vroege replicatie. Echter, een alternatief model suggereert dat het chromatine gemonteerd tijdens de replicatie en de verschillende chromatine regulatoren bij het begin en het einde van S-fase leidt tot differentiële verpakking van vroeg en laat replicerende gebieden ^{1, 14} </sup>. We hebben onlangs aangetoond dat de ToR geeft vorm aan de GC-gehalte van invloed zijn op de aard van de mutaties die zich voordoen in verschillende genomische regio's ^11.

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is de belangrijkste methode voor het meten ToR op individueel loci. Het is eenvoudig uitgevoerd door het tellen van het percentage S-fase cellen die één FISH signalen versus percentage doubletten voor een bepaald allel ^{15, 16} vertonen. Een alternatieve methode bestaat uit het labelen van de puls DNA met BrdU, sorteren van cellen op basis van hun DNA inhoud aan verschillende tijdstippen langs S, immunoprecipitatie DNA met BrdU en controleren van de overvloed aan DNA neergeslagen met ¹⁷ qPCR.

Genomische ToR mapping kan worden bereikt op twee manieren. De eerste methode is een genomische versie van de BrdU-IP hierboven beschreven, waarin de kwantificering van de hoeveelheidvan geprecipiteerd DNA in elke fractie gelijktijdig uitgevoerd voor het volledige genoom tot hybridisatie aan microarrays of diepe sequencing. De tweede methode, CNR-referentiekader, is gebaseerd op het meten van het aantal kopieën van elk genomisch gebied van S-fase cellen en het normaliseren van het DNA-gehalte in G1 cellen. Bij deze werkwijze worden de cellen gesorteerd door FACS in niet-replicerende (G1-fase) en repliceren (S-fase) groepen (Figuur 1). Cellen in G1 hetzelfde aantal kopieën in alle genomische regio en zullen hun DNA inhoud hetzelfde zijn. Anderzijds, het DNA kopieaantal in S afhankelijk van het referentiekader, sinds begin replicerende regio onderging replicatie in de meeste cellen en dus hun DNA-inhoud wordt verdubbeld, terwijl laat replicerende gebieden nog in de meeste cellen gerepliceerd en dus hun DNA inhoud analoog is aan die van G1 cellen. Vandaar de S om G1-verhouding van DNA-gehalte is een indicatie van het mandaat. De hoeveelheid DNA per genomisch gebied wordt gemeten door hybridisatie metmicroarrays of door diepe sequencing ^{2, 8.} De voordelen van het CNR-ToR methode zal verder worden besproken.

Dit document beschrijft de CNR-Tor methode voor het genoom ToR in kaart brengen, zoals beschreven in figuur 2. Het artikel bespreekt de fijne details van het gehele proces van het verzamelen van de cellen tot de fundamentele analyse van de resultaten en het creëren van genomische ToR kaarten. De in dit document beschreven protocol is met succes uitgevoerd op verschillende celtypen in kweek. Toekomstige verbeteringen van dit protocol kan leiden tot het in kaart brengen van het referentiekader in vivo en in zeldzame celtypen.