השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

במחקר רפואי, תשומת לב רבה מתמקדת חלבונים בממברנה, או פנימיים או חיצוניים, מעורבים במגוון אינטראקציות שומנים. עבודה עם חלבונים אינטראקציה השומנים כולל גם בחירת תחליף ליפידים, כגון חומרי ניקוי, amphipols ^1, או חלבונים קטנים ^2, או למצוא תחליף קרום שמחזיק את חלבון מסיס ופעיל. תחליפי קרום ליפואית כוללים ליפוזומים nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs הם פלטפורמות הממברנה כמעט טבעיות שפותחה על ידי הנדסה חלק חלבון, ApoA-1, של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) טבעי בדם. ApoA-1 הנו רשת 243 שאריות-ארוכה של סלילים-α amphipathic קצרים ויש לו קונפורמציה מסיס ליפיד חינם. במבחנה כאשר בנוכחות של שומנים, שני עותקים של חלבון ApoA-1 לסדר מחדש באופן ספונטני לכתר את hydrחלק בשרשרת acyl ophobic של תיקון bilayer השומנים ^5. גרסאות תכנון הנדסי של ApoA-1 נקראים בדרך כלל חלבונים פיגומים הממברנה (MSP), ואת מספר גדל והולך זמינים מסחרית כמו פלסמידים או חלבונים מטוהרים. חזרות או השמטות של הסלילים-α ב תוצאת ApoA-1 ב ⁶ ארוכים או קצרים ⁷ חלבונים בממברנה פיגומים. זה בתורו מאפשר ליצור דיסקים סביב 6 ננומטר ⁷ עד 17 ננומטר ⁸ קוטר. ישנם סוגים שונים של יישומים עבור nanodiscs ^{3, 9.} היישום הנפוץ ביותר הוא לספק סביבת קרום כמעט טבעית לייצוב של חלבון ממברנלי אינטגרלי ^8, ביקורת בעבר ^{3, 9.} אחד משימושים פחות בחנו הם לספק משטח הממברנה ננו לחקר חלבוני פריפרית קרום ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} סעיף 1 של פרוטוקול להלן ממחיש את ההליך להכנת nanodiscs מורכב פוספוליפידים וחלבונים פיגומים הממברנה.

הכנת מדגם היא צוואר בקבוק ברוב השיטות. דגימות שיטה ספציפית עשויות להוסיף מידע מסוים, אבל הם גם עושים השוואות של תוצאות קשות. לכן, זה פשוט יותר כאשר הדגימות הן multimodal וניתן להשתמש בו ישירות בכמה שיטות שונות. אחד היתרונות עם השימוש nanodiscs הוא גודלו הקטן של nanodisc בהשוואה ליפוזומים (למשל, דגימות יכול לשמש ישירות לשני TEM ו ג'ל אלקטרופורזה הלא denaturing, כמו בפרוטוקול הנוכחי).

<p class = "jove_content"> שלפוחית ​​ו ליפוזומים כבר מזמן השתמשו להבין את תפקידם של חלבונים אינטראקציה-קרום. עבור מחקרים מבניים להדמיה, דוגמא של הנחישות המבנית של חלבון טראנסממברנלי ב ליפוזומים היא ¹⁸ זמין. עם זאת, אין מבנה 3D ברזולוציה גבוהה של חלבון הממברנה monotopic מוטבע על קרום ליפוזום פורסמה עדיין, ככל שאנו יודעים. חלקיקים או נוגדני זהב יכולים לשמש כדי לחזות חלבונים מחייבים ליפוזומים או שלפוחית באמצעות ¹⁹ TEM. למרות בדיקות אלה הם מאוד ספציפיים, שהם עלולים להפריע לתהליך חלבונים קושרי הממברנה על ידי מיסוך באתר קרום מחייב או על ידי מיסוך תחומי העניין עם החלקים גמישים. זהב שכותרתו או חלבונים ומורכבי נוגדן בטח יכולים להיות מנותח על ג'ל, אבל זה יגדיל את עלות הניסוי.

למרות ליפוזומים הם פלטפורמה מצוינת, אחד לא יכול להיות בטוח כי פופיש ulation יחס מסוים של חלבון לכל liposome, תכונה שיכולה להיחקר על ידי שימוש nanodiscs ^20. בשנת ליפוזום, קו-פקטורי מצעים יכולים להיות לכוד בפנים המסיס. חומרים שהם קרום מסיסים יחלקו את אותו גורל לשני סוגי mimetics הממברנה. אף על פי כן, כמו אזור bilayer קטן ב nanodiscs, כמות קטנה יותר של חומר נדרשה כדי להרוות את קרומי nanodisc.

תפקוד החלבון הבנת דרך קביעת המבנה האטומי כבר חיוני בתחומים רבים של מחקר. שיטות לקביעת מבנה חלבון כוללות רנטגן ^21; תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ^{22, 23;} במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) ²⁴ בקירור, cryoEM. ההחלטה על ידי cryoEM לאחרונה שופרה מאוד, בעיקר בשל השימוש של דה אלקטרון הישירtectors ^{25, 26.} מקרומולקולות הם צלמו רזה, קרח זגוגי ²⁷ במצב כמעט טבעי. עם זאת, בגלל הקונטרסט הנמוך של מולקולות ביולוגיות, הם הופכים קשים לזהות בטווח הגודל של 100 – 200 kDa. לקבלת דוגמיות בגודל המתאים, איסוף נתונים יכול להתבצע ואת שיטת שחזור חלקיק בודד יכולה להיות מיושמת כדי להשיג מבנה ^28.

עם זאת, קביעת מבנה החלבון על ידי TEM הוא תהליך רב שלבי. זה מתחיל בדרך כלל עם ההערכה של מדגם monodispersity ב ^-29 שלילי כתם TEM באמצעות מלחים של מתכות כבדות כמו phosphotungsten (PT) ³⁰ או אורניום ^31. שחזור של מודל ברזולוציה נמוכה של מקרומולקולה המוכתמת שלילי עשוי בדרך כלל ועלול להניב מידע חשוב על המבנה המולקולרי ^29. במקביל,איסוף נתונים באמצעות cryoEM יכול להתחיל. יש להקפיד בעת הערכת נתוני TEM השלילית-כתם, כדי למנוע את הפרשנות השגויה של היווצרות artefact. Artefact אחד מסוים הוא ההשפעה של כתם PT על פוספוליפידים ליפוזומים ^32, וכתוצאה מכך ההיווצרות של מוטות ארוכות דומות ערימות של מטבעים במבט מהצד ^33. "רולו" או "ערימות" כזה (להלן מסומן כמו "ערימות") נצפו בשלב מוקדם עבור HDL ^34, ומאוחר יותר גם עבור nanodiscs ^35.

ההערמה והעיצוב מחדש של ממברנות עלולות להתרחש מסיבות רבות. לדוגמה, זה יכול להיגרם על ידי שיתוף גורמים כמו נחושת, שמוצג על ידי הדמיה TEM ב כתם אמוניום molybdate ^36. שבריר של ליפידים קרום ליפוזומים כלול לקבוצת ראש חומצת iminodiacetic מחק complexation מתכת ידי EDTA, ובכך לערום ליפוזומים לאחר התוספת של יוני נחושת <sעד class = "Xref"> 36. הנחת יכול להיות גם עקב אינטראקציה בין חלבונים על ידי חלבון או על bilayers שומנים בדם (הכתם בשימוש אינו מוזכר) ^37. היווצרות ערימה של פוספוליפידים ידי PT נצפתה בשלב מוקדם; עם זאת, עבודה לאחר מכן התמקדה סר או ביטול היווצרות חפץ זה ^38.

כאן, אנו מציעים שיטה לנצל את nanodisc NAPT הנגרמת לערום לחקר חלבונים קושרי קרום ידי TEM. בקיצור, חלבון מחייב על nanodiscs שימנע nanodiscs מן הערמה. למרות הסיבות לערום אינן ברורות, הוצע ³⁹ כי קיימת אינטראקציה אלקטרוסטטית בין פוספוליפידים וקבוצת phosphoryl של PT, בגרימת הדיסקים לדבוק כל (איור 1 א) אחר. ההנחה העומדת מאחורי פרוטוקול שלנו היא שכאשר חלבון נקשר nanodisc, רוב השטח פוספוליפידים אינו availa ble לאינטראקציה עם PT עקב הפרעה סטרית ידי החלבון. זה ימנע היווצרות מחסנית (איור 1B). שתי מסקנות אפשר להסיק. ראשית, המניעה לערום כלומר החלבון של העניין הכפיף אותו הקרום. שנית, מורכב החלבון-ND יכול להיות מטופלים עם שיטות עיבוד יחיד חלקיקי תקן ^{24, 40} לקבל מורפולוגיה מחוספסת של המתחם. יתר על כן, מנתח בשיטות כמו ג'ל אלקטרופורזה הלא denaturing או פיזור אור דינאמי יכול להתבצע.

כדי להדגים את ההשערה הזו, השתמשנו החלבון קושר קרום 5 lipoxygenase (5LO), העוסק במחלות רבות דלקתיות ^{41, 42.} חלבון 78-kDa זה דורש יוני סידן להיקשר הממברנה שלה ^43. למרות עמותת קרום זה נחקרה באמצעות בהרחבה ליפוזומיםs = "Xref"> ^{44, 45, 46} ו שברי קרום ^47, אלה לא יכולים לשמש לניתוח TEM ונחישות מבנה.

הכנת nanodiscs מתחיל ידי ערבוב MSP עם השומנים resuspended ב cholate נתרן חומר ניקוי. לאחר דגירה על קרח למשך 1 שעות, אבקת הכביסה מוסרת לאט מתערובת הכינון מחדש תוך שימוש בשרף כושר ספיג. סוג של חומר זה עשוי לעתים קרובות קלקר בצורת לתוך חרוזים קטנים. הם יחסית הידרופובי יש העדפה חזקה מחייב דטרגנט לעומת שומנים ^48. לאחר הסרת חרוזים הידרופובי וביצוע בירור באמצעות צנטריפוגה, nanodiscs הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל (SEC). Nanodiscs מטוהר מעורבב עם חלבון הממברנה monotopic (ורכיבים אפשריים) ב יחס equimolar (או יחסי מספר עבור טיטרציה) והם עזבו כדי react (15 דק '). ניתוח על פי TEM מתבצע על ידי החלת μL-סכומי המדגם על-משוחרר זוהרת, רשתות מצופות הפחם ולאחר מכן על ידי ביצוע מכתים שלילי עם NAPT. מדגם זהה וממתי aliquots הוחלו על רשתות TEM יכול לשמש לניתוח על ידי הלא denaturing או SDS עמוד-ג'ל אלקטרופורזה, כמו גם על ידי סוגים שונים של מדידות פעילות, ללא שינויים משמעותיים.