Özet

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

Published: February 03, 2017
doi:

Özet

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Abstract

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) tamamen kardiyomiyositlerde (hiPSC-CMS), endotel hücreleri (hiPSC-EC), ve düz kas hücreleri (SMC'lere) içine hiPSCs ayrıştırılması için uygulamadan önce, özel hücre tipleri, fakat geleneksel protokolleri ayırt edilmelidir genellikle düşük verim, saflık ve / veya zayıf fenotipik stabilitesi ile sınırlıdır. Burada, yeni hiPSC CMS, -ECs üretilmesi için protokoller ve -SMCs esas itibarıyla geleneksel yöntemlere göre daha verimli, hem de uygulama alanı üzerine oluşturulan bir sitokin içerikli bir flaster ile hücre enjeksiyonu birleştirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Yama uzun bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard sıkılmış olan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, enjekte edilen hücrelerin tutma hem de arttırır. miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının domuz modelinde olarak bütünleşme oranı daha yüksek, iki kat daha fazla olduğunuHücreler hücreleri ve yama hem sitokin içeren yama olmadan hücrelere kıyasla yama ve tedavi ile uygulanmıştır, fakat tek başına hücreleri ile, kalp fonksiyonu ve infarkt önemli iyileşmeler ile ilişkilidir.

Introduction

onlar hastanın bağışıklık sistemi tarafından reddedilmesi olmayan hücrelerin bir potansiyel olarak sınırsız aralığı ve miktar içine ayırt edilebilir, çünkü insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) rejeneratif hücre tedavisi için en umut verici ajanlar arasında yer almaktadır. (SMC'lere Bununla birlikte, kendi kendine replikasyon ve farklılaşması için kendi kapasitesi, tümör oluşumuna neden olabilir ve bunun sonucunda, hiPSCs tamamen bu kardiyomiyositlerde (CMS), endotel hücreleri (EC), ve düz kas hücreleri gibi özel hücre tipleri, ayırt edilmesi gereken ), uygulamadan önce. Hücre yönetiminin en basit ve en yaygın yöntemlerden biri direkt intramiyokardiyal enjeksiyon, ancak yerli miyokard dokusu ile aşılanan nakledilen hücrelerin sayısı son derece azdır. Bu yıpratma çok iskemik doku sitotoksik ortamına bağlanabilir; Ancak, fare embriyonik kök hücreler (EKH) iken yaralanmamış kalplerin, myokarddan içine doğrudan enjekte ouygulanan hücrelerin önemli bir bölümünün onlar esnasında üretilen yüksek basınçlar tarafından iğne izi aracılığıyla sıkılmış, belki de yönetim sitesine çıkıldı düşündürmektedir 3-5 saat 1 için tutuldu teslim 5 milyon hücre nly ~ 40% miyokard kasılma.

Burada, hiPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde (hiPSC CMS) 2, endotel hücrelerinin (hiPSC-EC) 3 ve düz kas hücreleri (SMC'lere) 4 oluşturmak için yeni ve büyük ölçüde daha etkili yöntemler sunar. Özellikle, bu hiPSC-SMC protokol ağırlıklı sentetik veya kontraktil SMC fenotip doğru hücreleri yönlendirerek somatik DKH'lerde 5 gözlenen morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin geniş taklit etmek ilk. Ayrıca, bir sitokin içeren fibrin s oluşturarak enjekte edilen hücrelerin melezleşmesi hızını artırır, hücre dağıtım için bir yöntem sağlarEnjeksiyon sitesi üzerinden atch. Yama, en az üç günlük bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard çıkan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, her iki hücre tutmanın geliştirilmesi görünmektedir.

Protocol

Tüm deney prosedürleri Birmingham Alabama Üniversitesi Hayvan Rehberine uygun olarak yapılmaktadır. 1. hiPSC-CM'ler içine hiPSCs Farklılaşan Kaplayın, gece boyunca 4 ° C'de önceden soğutulmuş büyüme faktörü azaltılmış jelatinimsi bir protein karışımı ile 6 delikli bir plakanın deliklerine. Kullanmadan önce, jelatinimsi protein karışımı aspire. % 5 CO2 ve 10 uM ROCK inhibitörü ile 37 ° C mTeSR1 orta ek hücreleri (oyuk başına 1 …

Representative Results

Farklılaştırılmış hiPSC-CM'ler, -ECs ve -SMCs karakterizasyonu HiPSCs ayırıcı kapasitesi, 4, 2 3 değerlendirildi. Sitometri son hiPSC-CM nüfusun saflık% 90 (Şekil 1A, 1B, panel B1) aşabilir düşündürmektedir kardiyak troponin T (cTnT) ifade analizleri Akış. Hemen hemen bütün hüc…

Discussion

hiPSC-CM'ler gelişmiş Verim / Saflık

CM'ler içine insan kök hücreleri farklılaştırarak için geleneksel protokoller genellikle düşük verim ve saflık ile sınırlıdır; Örneğin, hESC CM'ler sadece 35-66% yavaş miyozin ağır zincir ya da cTnT 6 dile Percoll ayrılması ve kardiyak vücut oluşumu yoluyla elde edilmiştir. Ayırt hiPSC-CM popülasyonlarının saflığı esasen promotere işlevsel olarak bağlanmış olan bir raportör geninin s…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).

Materials

Protocol 1
mTeSR1 medium Stem cell technologies 5850
Growth-factor-reduced matrigel Corning lifescience 356231
Y-27632 Stem cell technologies 72304
B27 supplement, serum free Fisher Scientific 17504044
RPMI1640 Fisher Scientific 11875-119
Activin A R&D 338-AC-010
BMP-4 R&D 314-BP-010
bFGF R&D 232-FA-025
Collagenase IV Fisher Scientific NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) Fisher Scientific 14175079
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10438018
6-well plate Corning Lifescience 356721
10cm dish Corning Lifescience 354732
Cell incubator Panasonic MCO-18AC
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 2
Versene Fisher Scientific 15040066
Fibrinogen Sigma-Aldrich F8630-5g
Thrombin Sigma-Aldrich T7009-1KU
EMB2 medium Lonza CC-3156
VEGF ProSpec-Tany CYT-241
EPO Life Technologies PHC9431
TGF-ß Peprotech 100-21C
EGM2-MV medium Lonza CC-4147
SB-431542 Selleckchem S1067
CD31 BD Bioscience BDB555445
CD144 BD Bioscience 560411
15 mL centrifuge tube Fisher Scientific 12565269
Eppendorff Centrifuge Eppendorf 5702R
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 3
CHIR99021 Stem cell technologies 720542
PDGF-ß Prospec CYT-501-10ug
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 4
Olive oil Sigma-Aldrich O1514
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
Glycine Sigma-Aldrich G8898
IGF R&D 291-G1-01M
Bovine serum albumin Fisher Scientific 15561020
Heating plate Fisher Scientific SP88850200
Water bath Fisher Scientific 15-462-10Q
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 5
CaCl2 Sigma-Aldrich 223506
ezh-aminocaproic acid Sigma-Aldrich A0420000
MEM medium Fisher Scientific 12561-056
Syringe Fisher Scientific 1482748
Anesthesia ventilator Datex-Ohmeda 47810
Anesthesia ventilator Ohio Medical V5A
Defibrillator Physiol Control LIFEPAK 15
1.5T MRI General Electric Signa Horizon LX
7T MRI Siemens 10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) Berlex 50419-188-02
2-0 silk suture Ethilon 685H
3-0 silk suture Ethilon 622H
3-0 monofilament suture Ethilon 627H

Referanslar

  1. Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
  2. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  3. Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
  4. Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
  5. Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
  6. Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
  7. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  8. Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
  9. Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
  10. Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
  11. Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
  12. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  13. Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
  14. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  15. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
  16. Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
  17. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  18. Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
  19. Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
  20. Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
  21. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Zhu, W., Gao, L., Zhang, J. Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (120), e55142, doi:10.3791/55142 (2017).

View Video