Özet

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

Published: February 03, 2017
doi:

Özet

我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。

Abstract

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs)が完全に投与する前に、特定の細胞型に分化されなければならないが、心筋細胞(hiPSC-CMS)にhiPSCsを区別するための従来のプロトコル、内皮細胞(hiPSC-ECS)、および平滑筋細胞(平滑筋細胞)は、しばしば低収量、純度、および/または貧弱な表現型の安定性によって制限されます。ここで、我々は、新規hiPSC-のCMを生成するためのプロトコル、-ECs、実質的に従来の方法よりも効率的です-SMCs、ならびに投与のサイト上で作成されたサイトカインを含むパッチで細胞注入を組み合わせるための方法を提示します。パッチは、長期間にわたってインスリン様成長因子(IGF)を放出することにより、心筋から絞り出されてから細胞を防ぐために、針の軌道、及び細胞生存を封止することにより、注入された細胞の保持の両方を改善します。心筋虚血再灌流傷害のブタモデルにおいて、生着率が時より2倍大きかったです細胞は、細胞とパッチの両方を有するサイトカイン含有貼付せずに細胞に比べ、パッチ、および治療を投与したが、一人ではない細胞を用いて、心機能および梗塞サイズの大幅な改善と関連していました。

Introduction

ヒトの人工多能性幹細胞(hiPSCs)は、患者の免疫系によって拒絶されていない細胞の潜在的に無限の範囲と量に分化させることができるので、再生細胞療法のための最も有望な薬剤の一つです。 (平滑筋細胞を但し、自己複製および分化のための能力はまた、腫瘍形成につながる可能性があり、その結果、hiPSCsは、完全にこのような心筋細胞(CMS)、内皮細胞(EC)、および平滑筋細胞などの特定の細胞型に分化することが必要)、投与前。細胞投与の最も簡単で最も一般的な方法の1つは、直接心筋内注射であるが、本来の心筋組織により生着された移植細胞の数が非常に低いです。このスレの多くは、虚血組織の細胞毒性環境に起因することができます。しかし、マウスの胚性幹細胞(ESC)は、O、無傷心臓の心筋に直接注入しました。NLY〜配信500万細胞の40%は、それらが中に製造された高圧力によって針トラックを通って絞り出されたせいか、投与された細胞のかなりの割合は、投与部位を終了したことを示唆している3-5時間1、のために保持しました心筋収縮。

ここでは、(SMCの)4 hiPSC由来の心筋細胞(hiPSC-CMS)2、内皮細胞(hiPSC-ECS)3、および平滑筋細胞を生成するための新規かつ、実質的に、より効率的な方法を提示します。注目すべきは、このhiPSC-SMCプロトコルは、主に合成または収縮SMC表現型に向かって細胞を向けることによって、体細胞のSMC 5で観察された形態学的および機能的特性の広い範囲を模倣する最初のものです。我々はまた、サイトカインを含むフィブリンPを作成することにより、注入された細胞の生着率を改善細胞送達の方法を提供します注射部位の上にATCH。パッチは、少なくとも3日間の期間にわたってインスリン様成長因子(IGF)を放出することにより、心筋から出るセルを防止する針トラック、及び細胞生存を封止することにより、両方の細胞保持を改善するように見えます。

Protocol

全ての実験手順は、アラバマ大学バーミンガム校の動物ガイドラインに従って行われています。 1. hiPSC-のCMにhiPSCsの区別一晩4℃で予め冷却した成長因子低減ゼラチン状タンパク質混合物でコート6ウェルプレートのウェル。使用前にゲル状のタンパク質混合物を吸引。 10μMのROCK阻害剤とのmTeSR1培地補充で5%CO 2、37℃で細胞(ウェル当たり1×10 5細?…

Representative Results

差別hiPSC-CMを、-ECs、および-SMCsのキャラクタリゼーション hiPSCsの微分容量は2、3、4を評価しました。フローサイトメトリー心臓トロポニンT(cTnTの)の発現の分析は、最終的なhiPSC-CM集団の純度は90%( 図1A、1B、パネルB1)を超え…

Discussion

hiPSC-のCMの歩留まりの向上/純度

CMSにヒト幹細胞を分化するための従来のプロトコルは、多くの場合、低い収率および純度によって制限されます。例えば、ヒトES細胞-CMSのわずか35から66まで%は遅いミオシン重鎖またはcTnTの6を表明パーコール分離および心臓体形成を介して得られます。分化hiPSC-CM集団の純度は、実質的にCM特異的タンパク質<s…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).

Materials

Protocol 1
mTeSR1 medium Stem cell technologies 5850
Growth-factor-reduced matrigel Corning lifescience 356231
Y-27632 Stem cell technologies 72304
B27 supplement, serum free Fisher Scientific 17504044
RPMI1640 Fisher Scientific 11875-119
Activin A R&D 338-AC-010
BMP-4 R&D 314-BP-010
bFGF R&D 232-FA-025
Collagenase IV Fisher Scientific NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) Fisher Scientific 14175079
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10438018
6-well plate Corning Lifescience 356721
10cm dish Corning Lifescience 354732
Cell incubator Panasonic MCO-18AC
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 2
Versene Fisher Scientific 15040066
Fibrinogen Sigma-Aldrich F8630-5g
Thrombin Sigma-Aldrich T7009-1KU
EMB2 medium Lonza CC-3156
VEGF ProSpec-Tany CYT-241
EPO Life Technologies PHC9431
TGF-ß Peprotech 100-21C
EGM2-MV medium Lonza CC-4147
SB-431542 Selleckchem S1067
CD31 BD Bioscience BDB555445
CD144 BD Bioscience 560411
15 mL centrifuge tube Fisher Scientific 12565269
Eppendorff Centrifuge Eppendorf 5702R
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 3
CHIR99021 Stem cell technologies 720542
PDGF-ß Prospec CYT-501-10ug
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 4
Olive oil Sigma-Aldrich O1514
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
Glycine Sigma-Aldrich G8898
IGF R&D 291-G1-01M
Bovine serum albumin Fisher Scientific 15561020
Heating plate Fisher Scientific SP88850200
Water bath Fisher Scientific 15-462-10Q
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 5
CaCl2 Sigma-Aldrich 223506
ezh-aminocaproic acid Sigma-Aldrich A0420000
MEM medium Fisher Scientific 12561-056
Syringe Fisher Scientific 1482748
Anesthesia ventilator Datex-Ohmeda 47810
Anesthesia ventilator Ohio Medical V5A
Defibrillator Physiol Control LIFEPAK 15
1.5T MRI General Electric Signa Horizon LX
7T MRI Siemens 10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) Berlex 50419-188-02
2-0 silk suture Ethilon 685H
3-0 silk suture Ethilon 622H
3-0 monofilament suture Ethilon 627H

Referanslar

  1. Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
  2. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  3. Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
  4. Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
  5. Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
  6. Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
  7. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  8. Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
  9. Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
  10. Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
  11. Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
  12. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  13. Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
  14. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  15. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
  16. Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
  17. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  18. Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
  19. Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
  20. Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
  21. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Zhu, W., Gao, L., Zhang, J. Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (120), e55142, doi:10.3791/55142 (2017).

View Video