Özet

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Published: February 03, 2017
doi:

Özet

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Abstract

Human geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) moet volledig worden onderscheiden in specifieke celtypen voorafgaand aan toediening, maar de conventionele protocollen voor differentiëren hiPSCs in hartspiercellen (iPSC-CMS), endotheelcellen (iPSC-EC), en gladde spiercellen (SMC) zijn vaak beperkt door de lage opbrengst, zuiverheid, en / of slechte fenotypische stabiliteit. Hier presenteren we nieuwe protocollen voor het genereren iPSC-CM, -ECs en -SMCs die aanzienlijk efficiënter dan conventionele methoden, alsmede een werkwijze voor het combineren celinjectie met cytokine-bevattende pleister gemaakt via toedieningsplaats. De patch verbetert zowel de retentie van de geïnjecteerde cellen bij het afdichten van de naald weg te voorkomen dat de cellen van wordt geperst uit het myocardium en celoverleving, door het vrijgeven van insulineachtige groeifactor (IGF) over een langere periode. In een warkensmodel van myocardiale ischemie-reperfusieschade, het percentage enting was meer dan twee keer groter is vancellen werden toegediend met cytokine-bevattende pleister vergelijken met de cellen zonder patch, en behandeling met zowel de cellen en de pleister, maar niet de cellen alleen werd geassocieerd met een significante verbetering in hartfunctie en infarctgrootte.

Introduction

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) behoren tot de meest veelbelovende middelen voor regeneratieve celtherapie omdat ze kunnen worden onderscheiden in een potentieel onbeperkte waaier en de hoeveelheid cellen die niet worden afgewezen door het immuunsysteem van de patiënt. Echter, hun capaciteit voor zelf-replicatie en differentiatie leiden tot tumorvorming en derhalve dient hiPSCs volledig worden onderverdeeld in specifieke celtypen, zoals hartspiercellen (CM), endotheelcellen (ECs) en gladde spiercellen (SMC ), voor toediening. Een van de eenvoudigste en meest voorkomende methoden cel toediening directe intramyocardiale injectie, maar het aantal getransplanteerde cellen die zijn geënt met de natieve myocardiaal weefsel uitzonderlijk laag. Veel van dit verloop kan worden toegeschreven aan de cytotoxische omgeving van het ischemische weefsel; wanneer echter muriene embryonale stamcellen (SER) werden direct geïnjecteerd in het myocardium van niet-beschadigde harten, only ~ 40% van de 5.000.000 cellen geleverd werden behouden gedurende 3-5 uur 1, hetgeen suggereert dat een aanzienlijk deel van de toegediende cellen verlieten de toedieningsplaats, misschien omdat zij uitgeknepen door de naald weg door de hoge drukken die tijdens myocardiale contractie.

Hier presenteren we nieuwe en aanzienlijk efficiëntere werkwijzen voor het genereren iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) 2, endotheliale cellen (EC-iPSC) 3 en gladde spiercellen (SMC) 4. Met name deze iPSC SMC-protocol is de eerste die de uiteenlopende morfologische en functionele kenmerken waargenomen in somatische SMC's 5 door het richten van de cellen naar een overwegend synthetisch of SMC contractiele fenotype nabootsen. Wij ook een werkwijze voor aflevering cel die de engraftment percentage geïnjecteerde cellen verbetert door een cytokine-bevattende fibrine patch op de injectieplaats. De pleister blijkt zowel celretentie verbeteren door het afdichten van de naald weg te voorkomen dat de cellen van het verlaten van het myocardium en celoverleving, door het vrijgeven van insulineachtige groeifactor (IGF) gedurende ten minste drie dagen.

Protocol

Alle experimentele procedures worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Universiteit van Alabama in Birmingham. 1. Differentiatie hiPSCs in iPSC-CMs Smeer de putjes van een 6-well plaat met pre-gekoelde groeifactor-gereduceerde geleiachtige eiwitmengsel bij 4 ° C voor de overnachting. Zuig het gelatineuze proteïnemengsel voor gebruik. Zaad de hiPSCs op de vooraf beklede platen en kweken van de cellen (1 x 10 5 cellen per putje) bij 5% CO2 en 37…

Representative Results

Karakterisering van gedifferentieerde iPSC-cms, -ECs en -SMCs De differentiële capaciteit van hiPSCs geëvalueerd 2, 3, 4. Flow cytometrie analyse van cardiale troponine T (cTnT) expressie suggereert dat de zuiverheid van het uiteindelijke iPSC-CM populatie 90% (Figuur 1A, 1B, paneel B1) kan overschrijd…

Discussion

Verbeterde Opbrengst / zuiverheid van iPSC-CM

Gebruikelijke protocollen voor het differentiëren van menselijke stamcellen in CM's zijn vaak beperkt door de lage opbrengst en zuiverheid; bijvoorbeeld, slechts 35-66% van de hESC-CM's verkregen via Percoll scheiding en cardiale vorming lichaam uitgedrukt langzaam myosine zware keten of cTnT 6. De zuiverheid van gedifferentieerde iPSC-CM populatie kan aanzienlijk worden verhoogd door het kiezen voor de expressie van…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).

Materials

Protocol 1
mTeSR1 medium Stem cell technologies 5850
Growth-factor-reduced matrigel Corning lifescience 356231
Y-27632 Stem cell technologies 72304
B27 supplement, serum free Fisher Scientific 17504044
RPMI1640 Fisher Scientific 11875-119
Activin A R&D 338-AC-010
BMP-4 R&D 314-BP-010
bFGF R&D 232-FA-025
Collagenase IV Fisher Scientific NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) Fisher Scientific 14175079
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10438018
6-well plate Corning Lifescience 356721
10cm dish Corning Lifescience 354732
Cell incubator Panasonic MCO-18AC
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 2
Versene Fisher Scientific 15040066
Fibrinogen Sigma-Aldrich F8630-5g
Thrombin Sigma-Aldrich T7009-1KU
EMB2 medium Lonza CC-3156
VEGF ProSpec-Tany CYT-241
EPO Life Technologies PHC9431
TGF-ß Peprotech 100-21C
EGM2-MV medium Lonza CC-4147
SB-431542 Selleckchem S1067
CD31 BD Bioscience BDB555445
CD144 BD Bioscience 560411
15 mL centrifuge tube Fisher Scientific 12565269
Eppendorff Centrifuge Eppendorf 5702R
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 3
CHIR99021 Stem cell technologies 720542
PDGF-ß Prospec CYT-501-10ug
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 4
Olive oil Sigma-Aldrich O1514
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
Glycine Sigma-Aldrich G8898
IGF R&D 291-G1-01M
Bovine serum albumin Fisher Scientific 15561020
Heating plate Fisher Scientific SP88850200
Water bath Fisher Scientific 15-462-10Q
Materials Company Catalog Number Yorumlar
Protocol 5
CaCl2 Sigma-Aldrich 223506
ezh-aminocaproic acid Sigma-Aldrich A0420000
MEM medium Fisher Scientific 12561-056
Syringe Fisher Scientific 1482748
Anesthesia ventilator Datex-Ohmeda 47810
Anesthesia ventilator Ohio Medical V5A
Defibrillator Physiol Control LIFEPAK 15
1.5T MRI General Electric Signa Horizon LX
7T MRI Siemens 10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) Berlex 50419-188-02
2-0 silk suture Ethilon 685H
3-0 silk suture Ethilon 622H
3-0 monofilament suture Ethilon 627H

Referanslar

  1. Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
  2. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  3. Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
  4. Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
  5. Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
  6. Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
  7. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  8. Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
  9. Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
  10. Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
  11. Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
  12. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  13. Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
  14. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  15. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
  16. Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
  17. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  18. Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
  19. Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
  20. Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
  21. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Zhu, W., Gao, L., Zhang, J. Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (120), e55142, doi:10.3791/55142 (2017).

View Video