異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム
Özet
The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
Abstract
間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）は、生体工学や再生医療に大きな約束を保持します。 MSCは組織培養プラスチックへの強い付着を介して複数の成体組織から単離し、次いで、さらに最も一般的にウシ胎児血清（FBS）を使用して、 インビトロで増殖することができます。 FBSは、MSCは、免疫原性になる可能性がありますので、MSC培養物におけるその存在は、細胞の臨床的および実験的なアプリケーションの両方を制限します。したがって、MSC培養のために化学的に定義された異種非含有（XF）メディアを用いた研究は非常に価値があります。 MSCの多くの有益な効果は、主に腫瘍壊死因子刺激遺伝子6（TSG6）及びプロスタグランジンE2（PGE2）などの免疫調節因子の分泌を介して、炎症及び免疫を調節するそれらの能力に起因しています。しかし、MSCは、これらの要因を生成するために活性化を必要とMSCの効果は、多くの場合、一過性であるため、大きな関心は、事前活性化細胞PRIOの方法を発見するために浮上していますそれらの使用rは、このように生体内での活性化のためのタイムラグを解消します。ここでは、3次元（3D）培養液で効率的に活性化するためのプロトコルやプライムMSCを提示します 化学的に定義されたXFの条件下で生体内でのこれらの予め活性化MSCを投与します。具体的には、まずXF培地を用いて球状MSCマイクロ組織または懸滴の「スフェロイド 'を生成し、球及び馴化培地（CM）は、様々な用途のために収穫することができる方法を示すための方法を説明します。第二に、我々は、遺伝子発現の画面を説明し、 インビトロでの機能アッセイは、迅速に細胞の抗炎症性及び抗癌の可能性を強調し、スフェロイドにおけるMSCの活性化のレベルを評価します。第三に、我々は、in vivo効力試験のためのマウス腹腔内にそのままMSCスフェロイドを注入する新規な方法を説明します。全体的に、プロトコルは、本明細書中で化学的に定義されたXF詐欺の下で予め活性化MSCを取得する主要な課題を克服しますditionsとは、治療のためのMSCスフェロイドを管理するための柔軟なシステムを提供します。
Introduction
間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）は、様々な再生医療のアプローチのための大きな可能性を示しています。 MSCは、最初は、骨髄の間質成分として単離したが、以降、脂肪組織1、2、3を含む多数の他の成体組織から得られました。興味深いことに、メイン単離方法は、ウシ胎児血清（FBS）の存在下で組織培養プラスチックにしっかりと付着するMSCの顕著な特性を包含する。この伝統的な分離技術は、2次元（2D）培養中のMSCの簡単かつ急速な拡大を可能にする一方で、それはまた、非常に人工的であり、重要な細胞特性4の潜在的な損失につながるネイティブ3次元（3D）環境の重要性を無視し、5 、6。したがって、3次元培養におけるMSCの研究では、どの従来の2D培養液より生理的であり、MSCの特性を「減少/失われた」の検索で浮上しています。また、大きな関心は、異種非含有（XFに）MSC培養および活性化のための化学的に定義された条件を特定し、ひいては臨床応用のための細胞がより容易にするために上昇しています。
多くの研究は、生体材料に、球状凝集体またはスフェロイドとして両方のMSCの3D培養を実証公開されています。 MSCのスフェロイド培養物は、前臨床または臨床試験における治療のための細胞の投与後の生体内での MSCの挙動を理解する方法として見られたのに対し、生体材料中のMSCは、最初に、細胞を播種した足場で損傷した組織を置き換えるために組織工学的アプローチのために設計されました4、5、7。興味深いことに、MSCのフォームスフェロイドは自発的に組織培養プラスチックへの付着は認められていないとき8、9、10。伝統的に、細胞凝集は、スピナーフラスコ法または液体オーバーレイ技術、腫瘍微小環境を模倣しようとする努力において、癌生物学において最初に使用される方法によって容易にしました。より最近では、追加の方法は、細胞へのプラスチック接着4、5、6を防止するために特定の化学薬品で予めコーティングした培養皿に細胞凝集を示すこと浮上しています。 MSCスフェロイドを生成するための最も単純で経済的な方法の一つは、多くの場合、胚性幹細胞から胚様体を生成するために使用された技術、懸滴培養それらです。ドロップ培養技術をぶら下げて、組織培養プラスチックへの細胞接着は、組織培養皿の蓋の下側に媒体の液滴で細胞を懸濁させ、重力が細胞aggregを促進させることによって防止されますドロップの頂点でエーション。スフェロイドの大きさを容易に制御することがハンギングドロップ培養は、特に容易にする、細胞濃度または滴体積を変えることによって操作することができます。
MSCの3D培養に関する初期の研究では、対応する2D 6、8、9と比較して、3Dでの細胞の特性のラジカル違いを実証しました。同時に、レポートは、 インビボでのMSCの有益な効果は、微小環境の合図によって活性化され、反応して、抗炎症性および免疫調節11因子生成するためになる能力に頼っていることを実証しました。興味深いことに、そのようなプロスタグランジンE2（PGE2）などのこれらの因子の多くは、腫瘍壊死因子刺激遺伝子6（TSG6）、および肝細胞増殖因子（HGF）のための道を開く従来の2DのMSCよりMSCスフェロイドによってはるかに大量に生産されましたのアイデア細胞8、12、13を活性化するために、3D培養物を使用して。また、3次元培養における遺伝子活性化は、マウス12への注入後に少なくとも部分的に、細胞活性化の、メカニズムを再現するように見えました。 インビボでの伝統的なMSCの効果は、多くの場合、遅延、過渡、および「ヒットして実行」と記載することができるされているように、実験での使用の前にMSCを活性化することによって、細胞の効果を延長し、より目立つことができます。過去数年の間に、MSCスフェロイドを用いて重要な機能的研究は、これらが炎症反応を抑制し、そのようなスフェロイドをプライミングしたMSC 2の魅力的な形を作る、マクロファージ、樹状細胞、好中球、およびT細胞などのエフェクター細胞に影響を与えることによって、in vivoで免疫を調節することができることが実証されています、3。また、intなどの抗癌分子の産生erleukin-24（IL-24）および腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）は、MSCを単層にMSCの相対的な3次元培養で標的癌治療8、10、14のために利用することができる現象が増加します。
組織培養プラスチックの使用だけでなく、FBSのみならず、必要な従来のMSC培養物として、臨床使用のためにMSCのスフェロイドをより容易にする別のハードルを克服しなければなりませんでした。この障害に取り組むために、我々は最近、特定の下MSCスフェロイドの形成は、化学的にXFの条件を定義し、得られたMSCのスフェロイドをFBS 14との条件で生成されたスフェロイドのような抗炎症同じと抗癌分子を生成するために活性化されたことが確立さを示しました。ここでは、これらの知見は、XFを使用して3D培養物で予め活性化MSCの生成を実証するいくつかの詳細なプロトコールに提示されていますメディア。また、プロトコルは共にマウスに完全な球状体を送達するための実用的な方法で、それらの抗炎症性、免疫調節性及び抗癌効果に関しては、MSCの活性化レベルを評価するための効果的な方法を説明し、その提示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
いくつかの研究及び臨床用途に使用するための最適なMSCは非常に彼らの利益を最大化するために活性化され、好ましくは例えばFBS等の異種培地成分からの潜在的な抗原の送達を最小限にするために、化学的に定義されたXF条件下で調製されるべきです。ここに記載されたプロトコルでは、1の方法を示している）2）3）、それらの抗に関しては回転楕円体のMSCの活性化レベルを評価し、XF条件下…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
Materials
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| 8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
Referanslar
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