A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
Werkzaamheid van kandidaat antibacteriële behandelingen moeten worden aangetoond in diermodellen van infectie als onderdeel van de ontdekking en ontwikkelingsproces, bij voorkeur in modellen waarin de beoogde klinische indicatie nabootsen. Een werkwijze voor het induceren robuuste longinfecties bij immunocompetente ratten en muizen wordt beschreven die het mogelijk maakt de beoordeling van behandelingen in een model van ernstige pneumonie veroorzaakt door S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae of A. baumannii. Dieren worden verdoofd, en een-agar gebaseerde entstof is diep gestort in de longen via niet-chirurgische intratracheale intubatie. De resulterende infectie consistent, reproduceerbaar en stabiel gedurende tenminste 48 uur en maximaal 96 uur voor de meeste isolaten. Studies met de markt antibacteriële middelen hebben aangetoond goede correlatie tussen in vivo tr in vitro gevoeligheid en overeenstemming tussen de farmacokinetische / farmacodynamische doelen bepaaldin dit model en klinisch geaccepteerde doelen waargenomen. Hoewel er een initiële tijdsinvestering bij het leren van de techniek, kan het snel en efficiënt worden uitgevoerd zodra vaardigheid is bereikt. Voordelen van het model onder meer afschaffing van de neutropenische eis, verhoogde robuustheid en reproduceerbaarheid, het vermogen om meer ziekteverwekkers en isoleert, verbeterde flexibiliteit in de studie van het ontwerp en de oprichting van een uitdagende infectie bij een immunocompetente gastheer te bestuderen.
Evalueren van de werkzaamheid van potentiële geneesmiddelen in diermodellen van infectie is een kritische component van de antibacteriële geneesmiddelen ontdekkingsproces. In vivo studies werkzaamheid belangrijke gegevens voor de besluitvorming over de spanwijdte van ontdekking inspanningen, van het ophelderen van de structuur-activiteit relaties (SAR) en het optimaliseren van lead chemische serie door middel van het bepalen van farmacokinetische-farmacodynamische (PK / PD) van de kenmerken van verbindingen en ondersteunende selectie dosis voor klinische ontwikkeling en reglementaire goedkeuring. Talrijke infectie dierlijke modellen zijn beschreven in de literatuur voor dit doel. Een van de meest voorkomende en meest gebruikte is het neutropene muis dijbeen infectie, die is ontwikkeld door Eagle 1, 2 en later door Vogelman en Craig 3, 4. Dit model is van onschatbare waarde voor de ondersteuning van de bepaling van bacteriële gevoeligheidsbreekpunten en voor het verstrekken van PK / PD targets voor de menselijke leidraad voor de dosering geweest. Er zijn vele examenselen waar de voorspellende vermogen van dit model is bewezen 4-7. Een van de nadelen van de dij infectiemodel is er geen direct belang voor longinfecties. Er is nu een grotere nadruk op die overeenkomen met de plaats van infectie in diermodellen om de plaats van infectie bij de mens; en dus op verbindingen voor de behandeling van longontsteking te bestuderen, is het ideaal om een longinfectie model bij dieren gebruiken.
Verschillende werkwijzen voor het induceren longinfecties bij proefdieren zijn beschreven en gebruikt voor antibacteriële werkzaamheid studies waaronder intranasale inhalatie, afzuiging via de orofaryngeale route, aërosol en chirurgische intratracheale inoculatie 8. In veel gevallen, de dieren (vooral muizen), worden neutropenische gemaakt om een robuuste longinfectie bereiken. Desondanks Ernstig immuungecompromitteerde, het aantal bacteriële pathogenen en stammen die levensvatbare virussen te produceren in knaagdierenbeperkt. Zo kan het moeilijk zijn om Haemophilus influenzae tr Acinetobacter baumannii succesvol vaststellen pneumonie modellen 9, 10, en zelfs meer virulente pathogenen zoals Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa tr Klebsiella pneumoniae, kunnen problemen opleveren 11-13.
In 1991, Smith beschreef een longinfectie model in immunocompetente gespeende ratten waarbij besmetting werd vastgesteld door de bevolking is bacteriën direct in de longen via een eenvoudige chirurgische intratracheale intubatie methode 14. Berry et al. wijziging van de werkwijze voor het infecteren muizen 15. Met een-agar gebaseerde inoculum Dit effect zorgt inoculatie sterke longinfecties bij zowel immunocompetente ratten en muizen met S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa tr A. baumannii. Het gemakkelijk kan een groot aantal isolaten, inclusief onderdak diverse weerstaankomstig determinanten en welke niet een levensvatbare infectie produceren via andere routes inenting. Het laat ook de werkzaamheid te bepalen in immunocompetente dieren, een aandoening die meer relevant dan de traditionele neutropenie muismodel voor patiëntenpopulaties die niet ernstig verzwakt immuunsysteem. De consistentie en de betrouwbaarheid van dit model over meerdere ziekteverwekkers en isolaten maakt het zeer geschikt voor antibacteriële werkzaamheid studies.
Voor optimale succes bij het reproduceren van deze infectie model, moet de volgende aanvullende suggesties worden beschouwd. Virulentie van nieuwe isolaten kan worden verbeterd door passeren van 2-3 maal in vivo voorafgaand aan gebruik in een studie. Bevroren bacteriële voorraden moeten altijd worden bereid uit een primaire in vivo afgeleide bron met zo weinig passages mogelijk van het origineel, en opnieuw bevriezen of hergebruik van ontdooide voorraad wordt ontmoedigd. Behulp recente klinische isolaten uit patiënten met pneumonie en / of bereiden culturen in log-fase groei kan ook bijdragen tot het stellen van de infectie te verbeteren. Een vijfvoudige verdunning in de agar (bv 2 ml zoutoplossing suspensie toegevoegd aan 8 ml agar) kan worden gebruikt in plaats van tien keer het bacterieel inoculum verhogen en het inoculum volume kan aangepast worden op basis van de grootte van het dier (bv 200 gl / dier gewoonlijk geïnoculeerd in 250 g ratten). Voorafgaand aan het toevoegen van de zoutoplossing in de bacteriesuspensieagar (dwz bij stap 2,3), de bacteriële dichtheid worden voorspeld of geschat door visuele inspectie, MacFarland normen of optische dichtheidsmetingen. Het is nuttig om bekend de in vitro groeikenmerken worden voor elk isolaat alvorens zij in vivo experimenten. Consistente groei en behandeling maakt de nauwkeurige schatting van de bacteriële dichtheid voor elk isolaat. Standaard microbiologische werkwijzen die verschillen van die beschreven, zoals alternatieve media en weefsel homogenisatoren, kan worden gebruikt als geschikt voor de bereiding van inocula en opsomming van bacteriën geïnfecteerd weefsel.
Het wordt sterk aanbevolen om voor te bereiden of smelt de agar de dag voor het experiment en op te slaan 's nachts in een aparte waterbad ingesteld op 50 ° C. Dit zal het proces vereenvoudigen en te beschermen tegen de agar te warm op het moment van infectie. Een temperatuur van 41-42 ° C bereikt een goede balans tussen maintaining de agar in vloeibare toestand zonder dat het te warm voor de korte termijn overleving van bacteriën. Als een mogelijk alternatief voor nutriënt agar is noble agar succes gebruikt in sommige experimenten. Een tube agar inoculum is meestal voldoende voor een gehele experiment (en aanbevolen), maar meerdere buizen kan worden voorbereid voor het infecteren van een groot aantal dieren (bijvoorbeeld meer dan 60) of wanneer het infecterende duurt langer dan 30-45 min als meerdere inoculum buizen vereist, voeg de bacteriesuspensie zoutoplossing aan elke buis agar zoals nodig. Dit vermindert het risico dat bacteriële overleving en / of draagkracht wordt beïnvloed door langdurige blootstelling aan een verhoogde temperatuur voorafgaand aan inoculatie. Opgemerkt wordt dat het gebruik van meerdere inoculum buizen mogen vragen extra dier randomisatie procedures. Waar mogelijk, infecteren alle dieren van dezelfde inoculum preparaat. Het wordt aanbevolen om de grootte van experimenten aan te passen aan het huidige niveau van vaardigheid met de technique.
Een ervaren wetenschapper kan intuberen en beënt een dier in minder dan 30 s en beënt tot 5-6 dieren per batch (dwz met een spuit vol agar inoculum). Voor die de techniek leert, snelheid belangrijk als de agar begint te stollen; echter nauwkeurige plaatsing van het inoculum is belangrijker. Begin met 1 of 2 dieren per partij, en toenemen als de techniek steeds meer vertrouwd. De dieren blijven ademen tijdens intubatie; derhalve het tijdvenster voor inoculatie afhankelijk van de snelheid waarmee het dier herstelt van isofluraan, waarvan ongeveer 2 moet – 3 min. Dieren die wakker tijdens het proces kan opnieuw verdoofd en probeerde een tweede keer, maar het is niet aan te raden om dit herhaaldelijk doen. Succesvolle inoculatie bij de eerste poging wordt verwacht in bijna 100% van de dieren na vaardigheid bereikt. Merk op dat het gemakkelijker is om de techniek leert aan de hand ratten eerst; muizen zijn gevoeliger en de kleinere tels zijn meer vatbaar voor verstopping met gestolde agar als ze niet snel gemanipuleerd. Voorverwarmen spuiten, slangen en zoutoplossing en het houden van de intubatie apparaat op een warm (niet heet) oppervlak, zoals een verwarmingselement op lage stand, kan helpen stollen van de agar te voorkomen. Wanneer de techniek leert, is het ook nuttig om juiste plaatsing van het inoculum oefenen met een donker gekleurde kleurstof (zoals geconcentreerde methyleenblauw) in plaats van de bacteriesuspensie in agar. Voer de procedure zoals beschreven, maar laten inslapen van het dier onmiddellijk na enting van de kleurstof (niet toe te staan het dier om te herstellen tussen de verdoving en euthanasie). Ontleden om te bepalen waar de kleurstof is geplaatst, en de techniek aan te passen.
Het primaire eindpunt in dit model is CFU van geïnfecteerde longen. Survival is geen goede indicator van bacteriële last en is geen aanbevolen eindpunt. Voor de werkzaamheid studies, de voorgestelde N 5-6 dieren per groep als deze is predicted detecteren ≥1 log10 CFU verschillen tussen groepen met ten minste 90% vermogen. Dieren kunnen besmet zijn groepen die kooi mates elkaar blijven, of een echte randomisatie proces kan worden gevolgd. Merk op dat als groepen worden toegewezen kooi moet de groepen geïnfecteerd in een willekeurige volgorde met het einde van de studie groei controles geïnfecteerd laatste (om bacteriële overleving bevestigen / fitness werd niet beïnvloed door de tijd blootgesteld aan een verhoogde temperatuur in het waterbad). Geen gegevens censoring methoden nodig moeten zijn, en geen aanbevolen behalve onmiddellijke verwijdering van alle dieren die duidelijk verkeerd geënt aan het begin van de studie (vóór de start van elke behandeling) is. Dieren die voorafgaand geëuthanaseerd het einde van de studie moet worden bemonsterd en resulteert in het stellen tenzij geldige reden voor uitsluiting prospectief geïdentificeerd data (dwz een geval los van de infectie of behandeling). Drug overdracht kan affect enkele voorbeelden en is een belangrijke overweging in alle in vivo infectie modellen. Wanneer een verbinding wordt gegeven vaak dicht bij de tijd van euthanasie of een lange halfwaardetijd, kan het aanwezig zijn in het weefsel homogenaat worden op een voldoende hoge concentratie blijven doden van bacteriën ex vivo tijdens de bacteriële inventariseren (verdunning en plating de monsters of op agarplaten tijdens de nachtelijke incubatie). Dit, actieve kool en / of een additief dat het werkzame molecuul degradeert zonder nadelige gevolgen voor de bacteriële cellen kan worden toegevoegd aan het monster voorafgaand aan homogenisatie te voorkomen. Andere werkwijzen omvatten centrifugeren van de monsters om de meerderheid van de actieve verbinding (die in het supernatant moet blijven) te verwijderen en gebruik verschillende verdunning en uitplaten regelingen voldoende verdunnen de actieve verbinding aan een niet-remmende concentratie.
Zoals blijkt uit de in figuur 2 voorbeelden dit model succesvol induces longinfecties bij knaagdieren met een breed scala van organismen, met inbegrip van degenen die niet goed groeien in andere modellen (zoals H. influenzae). Deze infecties zijn consistent en reproduceerbaar, waardoor de kans dat proeven moeten worden herhaald door model falen en / of slechte prestaties met een gegeven isolaat. Hoewel de dieren immunocompetente, niet in staat zijn de infectie oplossen snel, of helemaal niet. Dit zorgt voor een grotere flexibiliteit in studie lengte, zoveel isolaten handhaven van een levensvatbare infectie door ten minste 96 uur zonder de noodzaak van herhaalde injecties neutropenie handhaven. Het potentiële voordeel van studeren antibacteriële werkzaamheid bij immuuncompetente dieren werd eerder opgemerkt 20, 21, en er zijn aanwijzingen dat voor sommige verbindingen (bijv oxazolidinonen), gegevens van niet-neutropenische knaagdieren kan nauwkeuriger voorspellen menselijke blootstelling doelen vergeleken met die rendered neutropenie 5. De multi-purpose nut van tHij model wordt gedemonstreerd in figuren 3 tr 4 tr Tabellen 1 tr 2. Deze studies maken deel uit van een grote collectie niet gepubliceerde gegevens die zijn gegenereerd met dit model voorsprong optimalisatie inspanningen 16, 17 ondersteunen, 22-24, ter vergelijking en bevestiging van mens beoogde doseringsschema 19, 25-29 en PK / PD karakterisatie 18, 30-32 .Terwijl dit model aanvankelijk moeilijker te voeren ten opzichte van de intranasale inhalatie methode, zijn er vele voordelen zoals hierboven beschreven. Met de praktijk en routinematig gebruik, moet de technieken eenvoudig om te presteren.
Het kan worden opgemerkt in een aantal studies die de bacteriële belasting bij baseline was lager dan die doorgaans gericht op andere longinfectie modellen. Dit is grotendeels te danken aan de gewenste verdunning in agar en de kleine uitdaging volume, vooral bij muizen. Er moet echter ook worden opgemerktdat bacteriegroei werd waargenomen in alle gevallen, zelfs wanneer de initiële belasting relatief laag. Het minimumniveau vastgesteld hoeveelheid bacteriën 6-6,5 log10 CFU / longen (6,8-7,3 log10 CFU / g weefsel in muizen gebaseerd op gemiddelde gewichten longen) dat overeenkomt met dichtheden geschat menselijke patiënten met ernstige pneumonie 33. Een hogere basislijn last kan gebeuren door concentreren van het bacteriële inoculum of vertragen van het begin van verbinding toediening aanvullende bacteriegroei te kunnen beoordelen; echter uitgebreid uitdaging belasting te veel kan leiden tot abnormaal ernstige en acute ziekten (bijvoorbeeld overlijden in minder dan 24 uur) die ongevoelig is voor alle antibacteriële behandelingen ongeacht gevoeligheid. Hoewel het inoculum aanvankelijk bij voorkeur in de linkerlong van het dier wordt geplaatst, de infectie verspreidt veelal gedurende beide longen. Progressieve longziekte, verspreiding van de bacteriën naar andere organen, en uiteindelijk morbiditeit vaak OBSERVed met S. pneumoniae, K. pneumoniae tr P. aeruginosa. Van belang, infecties met H. influenzae tr A. baumannii zijn meestal meer bevatte en zelden leiden tot de dood bij de voorgeschreven bacteriële inocula.
Werkzaamheid resultaten van dit model zijn goed gecorreleerd met in vitro gevoeligheid profielen evenals omschreven PK / PD targets. Verlagingen van bacteriële belasting routinematig waargenomen isolaten geacht gevoelig voor het middel dat wordt getest, terwijl die resistent beschouwd vertonen geen verandering of bacteriegroei boven de basislijn 16, 17, 19, 24-29. Onderzoeken bij ratten evalueren twee chinolonen en macrolide gebruik van dit model 32 is gebleken dat de PK / PD doel nodig om een 1-log 10 vermindering van S. pneumoniae vergeleken met de uitgangswaarde gecorreleerd met de doelgroep vastgesteld neutropenische muizen en, nog belangrijker, met klinische doelstellingen voor de gemeenschap verworven bacteriële pneumonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, een nieuw mechanisme antibioticum, werd getest tegen meerdere S. pneumoniae en vereist een vergelijkbare PK / PD doelwit voor een 1-log 10 vermindering van deze longinfectie model 31 als dat nodig is voor een 1-log 10 vermindering van de neutropenische dij model 36 wanneer de longen binnendringen in aanmerking werd genomen (gegevens over bestand). Ook de PK / PD doelstellingen bepaald bij muizen voor GSK2251052 tegen P. aeruginosa waren consistent voor stasis, 1- en 2-log 10 vermindering van de CFU tussen deze long model 30 en de dij neutropenische infectie model toen de longen binnendringen werd beschouwd als 37, 38 . Correlatie met een neutropene longinfectie model met behulp van intranasale enting was slecht; echter GSK2251052 niet meer dan een statische reactie in deze studie 38 produceren. Dit kan worden toegeschreven aan de hogere bacterieel inoculum, die 8 log10 CFU / muis was zijn ten opzichte van 6 log <sub> 10 CFU / muis in de neutropenische dij 37 en intratracheale intubatie 30 modellen. Gegevensverzameling als deze is cruciaal voor benchmarking, omdat het directe vergelijking met bestaande modellen en correlatie met klinische gegevens aan de translationele voorspellende vermogen te beoordelen. Veralgemening van de intratracheale intubatie longinfectie model bijkomende gegevens over dit soort analyses.
Er zijn een aantal beperkingen van deze immuuncompetente longontsteking model. Ten eerste is het niet goed geschikt voor het evalueren ontstaan van spontane resistentie omdat de hoge bacterieel inoculum algemeen voor dergelijke studies leidt ook ernstige infectie vereist. Na pogingen bacteriële belasting van 7 of 8 log10 CFU bij aanvang, snelle morbiditeit waargenomen (dwz dieren steeds stervend in minder dan 24 uur) ondanks grondig wassen van de inocula op bestaande toxinen (gegevens bestand) wordt weggenomen. Hetkan mogelijk zijn om dit probleem op te lossen door grotere knaagdieren. Ratten, met name zwaardere ratten (> 250 g), de voorkeur te tolereren hogere inocula vergelijking met muizen en kan geschikt zijn voor dit type studies. Een tweede beperking is dat het gebruik van agar als infectie-enhancer kan uitsluiten het model voor evaluatie van bepaalde gastheer: pathogeen interacties. Er wordt aangenomen dat de agar verschaft een beschermde brandpunt tot infectie volledig binnen de longen wordt vastgesteld. Het is mogelijk om het inoculum in een zoutoplossing in plaats van agar om dit probleem te overwinnen leveren; echter, moet worden opgemerkt dat dit alleen produceert infectie met sommige isolaten. Ten derde is er een steile leercurve nodig om bekwamen in de techniek te worden. De procedure kan gevoelig zijn, vooral bij muizen. Het is gemakkelijk om per ongeluk plaats de metalen canule in de slokdarm, en excessieve kracht kan leiden tot lek van hetzij de slokdarm en de luchtpijp. Zorgvuldige plaatsing van het inoculum ookvereist of dieren mogen ofwel niet herstellen of niet adequaat worden besmet. Echter, met geduld en doorzettingsvermogen, kan men zeer bedreven worden en snel uit te voeren van de techniek, soepel en nauwkeurig.
Door het verwijderen van de eis van neutropenie, het verhogen van de robuustheid en reproduceerbaarheid, waardoor onderzoekers om meer ziekteverwekkers en isolaten te bestuderen, het verbeteren van de flexibiliteit van de experimentele opzet en het verstrekken van een uitdagende infectie farmacodynamische karakteriseren voor longontsteking, deze immuuncompetente longinfectie model voegt wezenlijke waarde aan de antibiotica ontdekking gemeenschap. Toenemend gebruik van dit model met extra onderzoekers zullen helpen zorgen voor de nodige benchmarking voor het naar meer brede acceptatie te krijgen en blijven verstrekken ondersteunende informatie over de juiste interpretatie.
The authors have nothing to disclose.
JH wenst te erkennen en dank mentor, vriend en voormalig manager Valerie Berry voor de eerste ons dit model onderwijs; en Gary Woodnutt, die ons de fundamenten van onderwees en inspireerde onze inzet op het gebied van antibacteriële PK / PD. Alle auteurs willen David Payne bedanken voor zijn steun en waardering voor onze wetenschap. Wij willen graag onze vroegere in vivo microbiologie collega's die hebben bijgedragen aan het lichaam van de gegevens die met behulp van deze methoden, met name Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni pagina en Nerissa Simon erkennen. Tot slot, onze dank gaat uit naar onze in-vitro-microbiologie collega's voor hun steun, met name voor het verstrekken van alle MIC's verzoeken wij (Lynn McCloskey, Josh West en Sharon Min); en voor onze klinische microbiologie team die deskundig advies en ondersteuning (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman en Deborah Butler) biedt.
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |