Ad alta densità elettroencefalografico Acquisizione in un modello di roditore Utilizzando risorse a basso costo e open-source

Gli studi condotti in tutta questa indagine erano d'accordo con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Università della Pennsylvania. 1. copricapo Progettazione e Costruzione Rimuovere ogni otto fila di pin del pin mattoni 2 x 50 di un connettore ricettacolo 100 posizione con un paio di pinzette spingendo la parte femmina del perno attraverso il mattone plastica. Nota: Perni rivolte verso il basso sarà l'orientamento che farà riferimento per il resto del protocollo. (Prendete nota di questo in particolare in 2.6). Coprire i perni con un leggero strato di smalto per isolare e lasciare che lo smalto asciughi completamente. Rimuovere lo smalto dalle punte dei perni con acetone e un piccolo panno. Tagliare l'eccesso di plastica del 2 x 7 di utilizzare una lama di rasoio o filo-taglio pliers. Questo si tradurrà in 2 x 7 mattoni che sono isolati lungo la lunghezza dei perni e esposti alla punta del perno. Questi diventeranno gli elettrodi EEG transcranica. Due 2 x 7 mattoni sono necessari per un completo allineamento elettrodo cronica (Figura 1A). Tagliate due 1 x 2 mattoni pin per la registrazione del segnale EMG. Utilizzare lo stesso processo di rimozione perni indesiderati con le pinzette e tagliare l'eccesso di plastica via per creare i mattoni 1 x 2. Assicurarsi che questi 1 x 2 sono un lato liscio per loro dall'originale 100 Posizione Presa come questa distanza sarà la distanza di pin standard per ogni testata per cui un singolo adattatore funzionerà per tutte le testate (Figura 1A). Utilizzare 2-parte epossidica per fissare il pezzo pin 1 x 2 al pin pezzo 2 x 7 (Figura 1D). Poiché entrambi i gruppi di perni devono essere nello stesso orientamento, epossidico 1 x 2 sulla parte laterale di due metà del casco con i lati lisci dei 1 x 2 e 2 x7 contatto tra loro. Allineare le 1 x 2 fori e perni con la parte posteriore-la maggior parte delle 2 file di perni sul 2 x 7. Nota: Le due metà del casco non sono Epossidico insieme. Ciò consente flessibilità entro i due metà dell'adattatore casco collegamento facile durante assuefazione e durante i giorni sperimentali (Figura 1E). Lasciate che le due metà copricapo cura durante la notte. Al termine, la testata è a simmetria bilaterale. Ogni mezzo è costituito da un perno mattoni 2 x 7 con un lateralmente divisoria 2 x 1 pin mattoni che è in linea con la maggior parte posteriore 2 righe del perno mattoni 2 x 7. Preparare i fili per la registrazione del segnale EMG. Singolo filamento, 31 G filo d'argento perfluoroalkoxy isolamento viene utilizzato per la registrazione di EMG del segnale (Figura 1D). Tuttavia, multi-incagliato o altri cavi di metallo può essere sostituito se lo si desidera. Per creare fili EMG toraciche hanno una lunga 3.0 cm pezzo di filo d'argento perfluoroalkoxy isolamento e REMove 1 cm dell'isolamento di plastica da una estremità con una lama di rasoio. Avvolgere il filo non isolato attorno ad una coppia di pinzette due volte. Rimuovere il filo dalla pinza e rimuovere 25 mm di isolamento sull'estremità non-loop con una lama di rasoio. Per costruire fili EMG cervicale, ripetere il processo con un segmento di 1,5 centimetri di filo. Due fili EMG cervicali e due fili EMG toracici sono necessari per un copricapo completo. Rimuovere il perno laterale nel lontano fila anteriore di entrambe le testate, che corrisponde ad una stereotassica coordinate di 3,3 millimetri anteriore Bregma e 2,3 mm lateralmente di Bregma, in quanto non vi è alcuna cervello sotto di questa posizione come determinato da un atlante cervello di topo 20 (Figura 2A). Su entrambe le metà copricapo, tagliare i perni del mattoncino 1 x 2 alla base plastica della testata con un paio di tronchesi (3,0 mm dalla punta del perno) e saldare il filo EMG cervicale al perno anteriore e toracica EMG al posteriore pin. Verificare che ogni pin è isolato elettricamente. Eseguire un test di continuità con un multimetro digitale collegando i due conduttori del voltmetro a diversi perni in modalità di continuità. Elettricamente perni isolati non produrranno un segnale acustico con questo test multimetro; tuttavia, i perni accoppiati elettricamente farà. Coprire i giunti saldati con smalto per unghie e una volta asciutto, piegare i fili EMG tale che essi sono in parallelo all'asse anteriore / posteriore con spostamento laterale minima. perni Trim per una lunghezza relativa tale che corrispondano al profilo superficie del cervello. Con l'aiutante di un mouse atlante del cervello, record di distanza ventrale di superficie del cervello da Bregma per ogni pin di coordinate. 20 Il perno la cui distanza dal ventrale Bregma è il più grande servirà come indicatore per il pin taglio. Questo pin non sarà tagliata, mentre tutti gli altri perni saranno tagliati rispetto a questo pin distanza massima ventrale (Tabella 1). Nota: Perni può essere macinato fino a dimensioni ma deve essere fatto con attenzione come l'attrito tra perno e mola può causare i piedini del casco per piegare. Se un pin è piegato, utilizzare una pinzetta per raddrizzare fuori. Un'alternativa alla macinazione dei perni giù lunghezza è tagliare loro con un paio di pinze taglio filo. Coprire tutti i suggerimenti pin con una soluzione d'argento con una penna d'argento soluzione e lasciare asciugare. Questo passaggio abbassa impedenze dell'elettrodo a ≤30 kΩ, che aumenta il rapporto segnale rumore e contemporaneamente elimina gli spigoli causati dal pin rifilatura, quindi facendo diminuire le probabilità di danno tissutale e accelerare il recupero da un intervento chirurgico. Un copricapo completati mezzo pesi circa 0,5 g. 2. Adattatore Edilizia e Assegnazione dei canali Tagliare i fili del connettore di un connettore a 36 posizioni doppia fila Maschio Nano-Miniature ad una lunghezza uniforme di 2 o 3 cm usando una lama di rasoio. Per ogni filo, strip off di 2,5 mm di isolamento dalla fine e lo stagno del metallo esposto per ogni filo. Assicurarsi che quando stagnatura di avere un unico filo sottile di filo in scatola per ogni filo adattatore nano come questo è fondamentale per isolare i pin. Tagliare la coibentazione spogliato con pinze a filo-taglio (Figura 1C). Creare un corrispondente connettore maschio / maschio alla testata utilizzando il Conn Striscia intestazione 2 x 50. Tagliate due 2 x 7 e di due 2 x 1 di da un 2 x 50 mattoni. Rimuovere perni indesiderati dal 2 x 50 mattone rompendo uno dei perni maschi, e poi spingere la ininterrotta seconda metà dello stesso pezzo fuori il connettore con un paio di pinzette (Figura 1B). Nota: Un lato di questi perni servirà come perni adattatori per collegare in ciascuna testata, mentre l'altra metà sarà saldato ai fili del connettore nano scatola. Assicuratevi di avere i bordi di plastica piane del toccante 2 x 1 e 2 x 7 per garantire il corretto accoppiamento del connettore maschio / maschio con la testata creata nel passaggio1. Saldare su uno dei cavi di terra / di riferimento dal connettore nano al pin terra / di riferimento desiderato. cavi di terra e di riferimento sono legati insieme sul chip dell'amplificatore RHD2132. Utilizzare l'unico perno che è 0,60 millimetri anteriore a Bregma e 1,00 mm lateralmente di Bregma sia come riferimento e la terra. (Casco sinistra, pin mediale della terza fila più anteriore, tuttavia, qualsiasi altro perno potrebbe essere assegnato se si preferisce, figura 2) Si noti che è possibile separare terra e riferimento sul chip dell'amplificatore rimuovendo il resistore 0Ω che lega terra e riferimento insieme se isolando i due è desiderato. Saldare i fili di collegamento nano in scatola sullo stesso lato dei connettori maschio / maschio, come la connessione pin di terra / di riferimento. Ogni filo associata a un canale specifico, in modo impostazione dei canali può essere completata in questo momento. diagrammi mappa canale per il headstages dell'amplificatore sono disponibili sul sito aperto Ephys Wiki (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Saldare il filo corrispondente cui canale è noto al rispettivo perno per ottenere la mappatura desiderata. Tagliare i fili inutilizzati alla base del connettore nano con le pinze di taglio del filo. Utilizzare un voltmetro per garantire che ogni pin è isolato elettricamente da tutti gli altri pin. Una volta che l'isolamento è confermato, applicare un sottile strato di smalto in giro ogni giunto di saldatura per isolare ulteriormente ogni pin. Utilizzando 2-parte epossidica, rafforzare l'adattatore corrispondente nano per i bilaterali 2 x 7 e 2 x 1 perni sui mattoni maschio-maschio. Nota: Ci saranno due metà di questo singolo adattatore che corrisponde alla disposizione dei pin delle metà copricapo creati in precedenza. È importante assicurarsi che la porzione mediale di ogni mezzo dell'adattatore non ha resina in eccesso traboccante il bordo di plastica del connettore maschio / maschio, in modo da evitare le due metà della testata essendo collegato simultaneamente. Non consentire epossidica di fluire al lato inferiore della por adattatore pinzione della scheda, come questo sarebbe anche impedire connessioni appropriate. Utilizzare le 2 metà copricapo come uno stampo per un corretto allineamento pin del connettore. Epossidico due metà dell'adattatore e resina epossidica della base del connettore nano per aumentarne la durata. Assicurarsi di coprire tutti i giunti di saldatura con resina epossidica. Lasciate che la notte adattatore cura. La conferma di una corretta assegnazione dei canali può essere effettuata utilizzando misure di impedenza nell'interfaccia utente grafica Open-Ephys (GUI). Un adattatore completato pesa circa 1,3 g (Figura 1F). 3. Chirurgia Preparare un campo chirurgico sterile. Indossare guanti sterili e altri dispositivi di protezione individuale richiesto. Sterilizzare strumenti in autoclave. Sterilizzare il telaio stereotassico con una soluzione di biossido di cloro 1.0 mM. Spruzzare la soluzione sul telaio ed attendere 5 minuti prima di risciacquo con acqua sterile. Per sterilizzare headp impiantabileparti IECE, spruzzare i componenti con una soluzione di biossido di cloro 1,0 mm, e attendere 5 minuti prima di risciacquare con acqua sterile. Posizionare l'hardware impiantabile ormai sterile in una piastra di Petri sterile. Ottenere un peso pre-chirurgica per il mouse, quindi anestetizzare il mouse in una camera di induzione 200 ml usando 1,5-2,0% isoflurano in ossigeno al 100%. Utilizzare una portata nella camera di circa 500 ml / min. Conferma perdita del riflesso di raddrizzamento ruotando camera di induzione. Rimuovere il mouse dalla camera di induzione e posto nel cono del naso sul telaio stereotassico senza garantire completamente la testa del mouse con le barre orecchio. Continuare a monitorare la corretta profondità dell'anestesia dalla valutazione punta pizzico ma anche di valutare i segni vitali. Mantenere la temperatura corporea a 37 ° C con un regolatore di temperatura a circuito chiuso, come un sistema pad sonda e riscaldamento rettale. Coprire gli occhi del mouse con unguento oftalmico occhio prima di tagliare fuori la pellicciasulla parte superiore del cranio con forbici curve o tagliaunghie. Disinfettare la testa con betadine e consentire il betadine si asciughi completamente prima di procedere. Somministrare analgesici e antibiotici insieme con fluidi intraperitoneale. Per un 25 g del mouse, 0,5 mg cefazolina, 0,125 mg di meloxicam, 0,5 ml di soluzione salina, e 2,5 mg di buprenorfina q 4-6 ore prn. Iniettare 250 microlitri 0,25% sottocutanea bupivacaina lungo la linea mediana sulla testa, e iniettare 100 microlitri 0,25% bupivacaina sottocutanea su entrambi zigomatica del mouse. Fissare il mouse nel telaio stereotassico ed esporre il cranio. Fissare la testa del mouse con le barre orecchio stereotassica al telaio stereotassico. Assicurarsi che il mouse è un aereo chirurgico di anestesia confermando l'assenza del riflesso punta pinch. Creare un'incisione 1.5-2.0 cm oltre ad No. 11 bisturi monouso lungo la linea mediana del cranio. L'incisione partirà tra gli occhi e continuare posteriormente all'occipite. </ Li> Esporre il cranio diffondendo la pelle lateralmente con morsetti micro. Ridurre concentrazione isoflurano dal 2,0% ad una concentrazione che mantiene un piano chirurgica di anestesia, ma non ridurre a inferiore 1,0% isoflurano in ossigeno al 100%. analgesia pre-operatoria riduce la quantità di anestetico inalato necessario per mantenere una profondità chirurgica di anestesia, e può portare a un più rapido recupero e miglioramento dei risultati di sopravvivenza. Livellare i fori bava cranio e trapano. Identificare Bregma e azzerare le coordinate stereotassica in Bregma, che diventa l'origine del sistema di coordinate. Per livellare il cranio nell'asse mediale / laterale, spostare una sonda livellamento collegato a un braccio manipolatore stereotassico 1,50 millimetri lateralmente in entrambe le direzioni da Bregma e confermare che la dorsale / profondità ventrale è minore di 0,05 mm quando i contatti sonda sinistra e destra lati del cranio. Nota: La risoluzione 10 micron di dorsale / ventrale ar manipolatoresto utilizzato in combinazione con un digitale visualizzazione delle coordinate semplifica livellamento. Livellamento l'asse anteriore / posteriore sulla Bregma segue la stessa tecnica. La differenza nella distanza ventrale per contattare Bregma e Lamda dovrebbe essere inferiore a 0,05 mm. Regolare il cranio fino livellamento è completa in entrambe le direzioni in modo che il piano trasversale è parallelo al terreno. Questo permette di vere coordinate stereotassica come si vede nelle atlante cervello di topo. 20 Con un diametro di punta micro punta 0,5 millimetri all'interno di un trapano stereotassico, praticare dei fori radica da 3,30 millimetri anteriore a 4.50 mm posteriormente al Bregma con incrementi di 1,30 mm a 1.00 mm in direzione laterale alla linea mediana su entrambe le metà del cranio. Per le colonne laterali di elettrodi 2,30 mm, fori trapano bave dal 2,00 mm anteriormente bregma a 4.50 mm posteriormente al Bregma in incrementi di 1,30 mm su entrambi i lati della linea mediana (Figura 2). L'elevata accuratezza e precisione che è richiesta per questo droperazione Illing è semplificata dalla risoluzione 10 micron di un braccio manipolatore stereotassico digitale. Nota: Affinché i pin del casco correttamente essere impiantati, il cranio del mouse deve essere saldamente in posizione all'interno del telaio stereotassico. Se il cranio si muove durante la perforazione, il disallineamento dei fori copricapo e radica può derivarne. Impiantare le testate. Con pinze diritte, preparare i tunnel filo EMG per i fili EMG toraciche. Scavare 2,5 cm tra la pelle ei muscoli nella parte posteriore per entrambi i fili di EMG sinistro e destro. Inserire il toraciche e cervicali EMG nella cavità creata con le pinze diritte prima, e poi manovrare il mattone EEG con pinze curve in modo tale che i perni si allineano con i fori di bava precedentemente perforati. Applicare una leggera pressione sulla testata e muovere i perni nel cranio. diametro del perno è 0,46 mm. Con isolante smalto, i perni si inserisce perfettamente nella bava forato holes. Il casco sarà stabile una volta che è opportunamente inserito. Regolare i fili EMG a posizioni finali. Ripetere la stessa procedura per la testata sul lato opposto. Fissare la testata in posizione con cemento dentale. Quando entrambe le testate sono fissati in luogo, mescolare rapporto 1: 1 di metacrilato di metile con la sua mescola reticolazione. Applicare la miscela tale da coprire il cranio esposto, parti di unghie lucidato degli elettrodi pin, e la porzione prossimale di fili EMG, ma non copre gli innesti della testata. Essere sicuri di non ottenere il cemento sulla pelliccia. Non consentire creste di cemento per formare che il mouse possa afferrare. Garantire un tempo sufficiente per il cemento ad asciugare, e quindi rimuovere il mouse dal telaio stereotassico. Il peso totale che il mouse dovrà trasportare è da 2 metà del casco e il cemento di fissaggio è di circa 1,2 g. Posto l'animale in un ambiente pulitozona di recupero. Mantenere la temperatura corporea con una piastra elettrica. Monitorare il mouse fino a quando non recupera tutti i riflessi posturali, a significare emersione dall'anestesia. alloggiamento individuale è raccomandato per il recupero a lungo termine. Il monitoraggio quotidiano per un minimo di 3 giorni dopo l'intervento è consigliato con l'analgesia interventistica. Lasciare 10-14 giorni di recupero post-operatorio prima di iniziare un periodo di assuefazione tethered. 4. abituare gli animali per Tethering Collegare l'adattatore per il mouse usando un poggiatesta del mouse (Figura 1G-H). Tenere su angoli opposti del copricapo che sono cementati in posizione con hemostats curve una volta che il mouse viene trattenuto e inserire lentamente i perni adattatore nella testata impiantato su entrambi i lati. Collegare l'amplificatore a 32 canali per l'adattatore (Figura 1 H). Assicurarsi di allineare i loghi sia sul adattatore e amplificatore in un coorientamento nsistent sia per l'adattatore e l'amplificatore per evitare errori di canale di mappatura. Collegare l'amplificatore di un cavo di interfaccia periferica seriale (SPI) di serie RHD2000. Questo cavo si connetterà al sistema di acquisizione per la registrazione del segnale. Posizionare il mouse all'interno di una camera in cui è installato sulla parete della camera di un braccio a sbalzo. Collegare il cavo di interfaccia SPI al braccio a sbalzo e regolare la tensione nel braccio a sbalzo per contrastare il peso del cavo legato. Il mouse è in grado di muoversi liberamente ed è abituata per un'ora al giorno della settimana prima della registrazione. Per scollegare il mouse, è sufficiente scollegare il cavo e l'adattatore dal mouse mentre si utilizza un piatto in acciaio inox micro spatola per aiutante nella scollegare l'adattatore dal mouse. Configurazione 5. Sistema estrazione del segnale di registrazione / Segnale Inserire l'adattatore costruito nella testata di un mouse impiantato. Collegare un amplificatore headstage all'adattatore ecollegare un cavo di interfaccia standard SPI all'amplificatore ed alla scheda di acquisizione. Avere il cavo SPI subordinare una cantilever correttamente tesa in modo che il peso supplementare sulla testa del mouse viene minimizzata. Posizionare una gabbia di Faraday locale, creato con lo svolgimento di maglia o un foglio di alluminio, attorno al headstage e mettere a terra la gabbia di Faraday locale. Ottenere impedenze degli elettrodi prima dell'inizio di ogni registrazione selezionando a 30 kS / s frequenza di campionamento e misura impedenze attraverso il modulo nella GUI. Un valore di impedenza inferiore o uguale a 10 kW per una spina individuo è richiesto per la conferma della corretta contatto dell'elettrodo. valori di impedenza più alti producono i dati respinti da quella degli elettrodi. Per la registrazione, creare una catena di ritmo FPGA, Bandpass Filter, e visualizzatore LFP nella GUI del segnale. Si consiglia di selezionare una frequenza di campionamento di 1,00 kS / s, larghezza di banda di 0.1-7,500 Hz e deselezionare DSP. Impostare il filtro passa-banda di 0,1-250 Hz e visualizzare i canali per opzare lo spettatore LFP. 250 e 400 ampiezze di canale mV con metodo draw selezionati migliore visualizza i dati. Iniziare la registrazione utilizzando l'interfaccia grafica. Creare una nuova cartella per ogni registrazione e impostare il percorso per il salvataggio dei file in quella cartella. Per iniziare una registrazione è sufficiente premere record. Tutti i 32 canali del connettore vengono registrati di default, ma canali indesiderati possono essere deselezionati cliccando sul lato destro del modulo FPGA ritmo prima dell'inizio della registrazione. Importazione di dati in MATLAB per l'analisi. Ci sono una moltitudine di cassette open-source che possono essere utilizzati per aiutare in analisi.