Bir Kemirgen Modelinde Yüksek yoğunluklu Elektroensefalografik Toplama Düşük maliyetli ve Açık kaynak Kaynakları Kullanma

Bu soruşturma boyunca yapılan çalışmalar Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes ile anlaşmaya vardı ve Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Başlık Parçası Tasarım ve İnşaat plastik tuğla ile pimin hazne kısmını iterek bir cımbız ile 100 pozisyon hazne konnektörü 2 x 50 pin tuğladan pimleri her sekizinci satırı kaldırın. Not: aşağı bakacak iğneler protokol geri kalanı için başvurulan edilecek yönlendirme olacaktır. (Özellikle 2.6 Bu not alın). yalıtmak ve oje tamamen kuruması için oje çok hafif bir ceket ile işaretçilerine örtün. aseton ve küçük bir bezle pim uçlarından oje çıkarın. Bir jilet veya tel kesme p kullanarak 2 x 7 en aşırı plastik Trimliers. Bu pim uzunluğu boyunca yalıtılmış ve pim ucunda maruz 2 x 7 tuğla neden olur. Bunlar sonuçta transkranial EEG elektrotları olacak. İki adet 2 x 7 tuğla tam bir kronik elektrot dizisinin (Şekil 1A) için gereklidir. EMG sinyali kayıt için iki adet 1 x 2 pin tuğla kesin. Cımbız ile istenmeyen işaretçilerine kaldırılması ve 1 x 2 tuğla oluşturmak için uzak aşırı plastik kesme aynı işlemi kullanın. Bu mesafe, böylece tek bir adaptör bütün başlık parçaları (Şekil 1A) için çalışacak her headpiece standart pin mesafesi olacak şekilde bu 1 x 2 orijinal 100 Pozisyon Receptacle onlara yumuşak bir tarafı olduğundan emin olun. 2 x 7 pin parçasının (Şekil 1D) 1 x 2 pin parça takmak için 2 parçalı epoksi kullanın. pim, her iki seti de aynı yönde olması gerektiği gibi, 1 x 2 ve 2 x düzgün yanlarıyla baş kısmının her iki yarısının yan tarafında 1 x 2 epoksi7 birbirine temas. 2 x 7 pimleri arka-en fazla 2 satır ile 1 x 2 iğne delikleri ve işaretçilerine hizalayın. Not: headpiece iki yarısı birbirine epoxied değildir. Bu alışkanlık sırasında daha kolay bağlantı için başlık adaptör iki yarısı olan esnekliğe ve deneysel gün (Şekil 1 E) sırasında sağlar. başlık yarıları gecede tedavi edelim. Tamamlandığında, başlık bilateral simetriktir. Her yarım 2 x 7 pin tuğla en fazla 2 satır posterior doğrultusunda bir yanal bağlı 2 x 1 pin tuğla ile 2 x 7 pin tuğla oluşur. EMG sinyali kayıt için kabloları hazırlayın. Telli tek, 31 G perfloroalkoksı yalıtımlı gümüş tel kayıt EMG sinyali (Şekil 1D) için kullanılır. Bununla birlikte, çok-şeritli ya da istenirse başka metal kablo ikame edilebilir. Torasik EMG teller perfloroalkoksi yalıtımlı gümüş tel ve rem bir 3,0 cm uzunluğunda bir parça almak oluşturmak içinbir jilet ile bir ucundan plastik yalıtım Ove 1 cm. iki kez bir cımbız etrafında olmayan yalıtılmış tel sarın. cımbız teli çıkarın ve bir jilet ile olmayan ilmekledi ucundaki yalıtım 25 mm kaldırın. Servikal EMG teller inşa etmek, tel 1,5 cm segment işlemi tekrarlayın. İki Servikal EMG teller ve iki göğüs EMG teller tam bir baş kısmını ihtiyaç vardır. Bir fare beyin atlas 20 (Şekil tarafından belirlenen bu konuma altında hiçbir beyin olmadığı için, bregma 3,3 mm ön ve bregma 2.3 mm yanal bir stereotaksik koordinatlar karşılık, her iki başlık parçaları en uzak ön satırda yan pimi, kaldır Şekil 2A). Her iki başlık yarısının üzerinde, (3,0 mm pin ucundan) tel makasları bir çift headpiece plastik taban 1 x 2 tuğla işaretçilerine kesilmiş ve ön pin ve göğüs servikal EMG tel lehim arka p EMGiçinde. Her pin elektriksel olarak izole olup olmadığını kontrol edin. süreklilik modundayken farklı pimleri voltmetre iki yol açar bağlayarak dijital multimetre ile bir süreklilik testi yapın. Elektriksel olarak izole pimleri bu multimetre testi ile bir uyarı sesi üretmek değil; Ancak, elektrik birleştiğinde pimleri olacak. minimal yan deplasman ön / arka eksenine paralel olacak şekilde EMG teller viraj, oje ve bir kez kuru ile lehimli eklemler örtün. göreceli uzunluğu Trim pimler beynin yüzey profiline uygun şekilde. Bir fare beyin atlas yardımcısı ile her pin için Bregma beyin yüzeyine rekor ventral mesafe koordinat. 20 olan ventral mesafe bregmadan pim süsleme için gösterge olarak görev yapacak en büyük pim. Diğer tüm iğneler Bu maksimal ventral mesafe pim (Tablo 1 ile ilgili olarak kesilir ise, bu PIN kesilmiş olmayacak). Not: iğneler boyutuna aşağı öğütülmüş olabilir ama headpiece pimleri bükülmesine neden olabilir pim ve öğütme tekerleği arasındaki sürtünme dikkatle yapılmalıdır. Bir pim bükülmüş ise, bunu düzeltmek için cımbız kullanın. uzunluğu aşağı işaretçilerine taşlama bir alternatif tel kesme bir pense ile süs etmektir. Bir gümüş çözüm kalemi kullanarak bir gümüş çözeltisi ile pim tüm ipuçları Kapak ve kurumaya bırakın. Bu adım, sinyal gürültü oranını arttırır ve aynı zamanda çıkıntılar nedenle doku hasarı olasılığını azaltmak ve ameliyat sonrası iyileşmesinin hızlandırılmasında pim kesme kaynaklanan ortadan ≤30 kH, elektrot empedanslarının düşürür. Tamamlanmış bir başlık yarım ağırlıkları yaklaşık olarak 0.5 gr. 2. Adaptörü İnşaat ve Kanal Haritalama Bir jilet kullanarak 2 ya da 3 cm üniform bir uzunluğa 36 Pozisyon Çift Sıra Erkek Nano-Minyatür Connector konektör kablolarını kesti. Her tel, st içinSonunda ve kalay her tel için maruz kalan metal yalıtım malzemesini 2.5 mm rip. Bu işaretçilerine izole etmek çok önemlidir her nano adaptör tel için kalaylı tel tek bir ince teli var Kalaylama zaman emin olun. Tel kesme pense (Şekil 1C) ile soyulmuş yalıtım snip. kullanarak baş kısmını bir uyan erkek / erkek konnektör oluşturma 2 x 50 tuğla Conn Şerit Başlık 2 x 50 Cut iki 2 x 7 en ve iki 2 x 1 en. Erkek iğnelerden birini kopararak 2 x 50 tuğla istenmeyen işaretçilerine çıkarın ve ardından bir cımbız (Şekil 1B) ile konnektörü kapalı aynı parçanın kesintisiz ikinci yarısında itin. Not: Adaptör pimleri her headpiece takmak için diğer yarısı kalaylı nano konektörü telleri lehimli olacak iken bu iğnelerden bir tarafı, hizmet edecektir. adımda oluşturduğunuz kemik ile erkek / erkek konnektörü uygun çiftleşme garanti altına almak için 2 x 1 ve 2 x 7 dokunmadan düz plastik kenarları emin olun1. İstenilen zemin / referans pin nano konektöründen zemin / referans tellerinin birinde lehim. Zemin ve referans telleri RHD2132 amplifikatör yongası üzerinde birbirine bağlanır. Bregma 0.60 mm ön ve referans ve zemin hem de bregma 1.00 mm yanal olan tek pimini kullanın. Yere bağlayan 0Ω direnci kaldırarak amplifikatör çipi üzerinde zemin ve referans ayırmak mümkün olduğunu unutmayın; (Sol headpiece, üçüncü en ön sıranın orta pin tercih ancak, başka bir iğne, Şekil 2. atanabilir) ve referans ikisini izole isteniyorsa. Zemin / referans pin bağlantısı olarak erkek / erkek konnektörleri aynı tarafına kalaylı nano bağlayıcı telleri lehim. Kanal kurulumu şu anda tamamlanmış böylece her tel, belirli bir kanala eşler. amplifikatör headstages Kanal harita şemaları Aç Ephys Wiki sitesinden (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home bulunur). kimin kanalı, ilgili pin bilinmektedir istenen haritalama elde etmek için gelen tel lehim. tel kesme pense ile nano konnektörü dibinde kullanılmayan telleri kesti. Her pin diğer tüm pimleri elektriksel olarak izole olmasını sağlamak için bir voltmetre kullanın. izolasyon onaylandıktan sonra, ayrıca her pimi izole etmek her lehim eklem çevresinde oje ince bir tabaka uygulayın. 2 parçalı epoksi kullanarak, erkek-erkek tuğla ikili 2 x 7 ve 2 x 1 pimleri uygun nano adaptörünü güçlendirir. Not: Daha önce oluşturulan başlık yarım pin uyuşabilecek bu tek adaptöre iki yarısı olacaktır. Bu aynı zamanda takılı olan headpiece her iki devreyi de önleyecektir gibi, adaptör her yarısının orta kısmı erkek / erkek konnektörü plastik kenar taşan fazla epoksi yok emin olmak için önemlidir. Herhangi bir epoksi pimi adaptörü por alt akmasına izin vermeyinBu kadar adaptörün tion, aynı zamanda uygun bağlantıları önleyecektir. Uygun bağlantı pimi uyum için bir kalıp olarak 2 başlık yarısını kullanın. adaptörün iki yarıyı epoksi ve dayanıklılığı artırmak için nano konnektörü tabanını epoksi. epoksi ile tüm lehim eklemleri kapsayacak şekilde emin olun. Adaptör tedavi gecede edelim. Uygun kanal eşleme teyit Açık Ephys grafik kullanıcı arayüzü (GUI) empedans ölçümleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Tamamlanmış bir adaptör yaklaşık 1.3 g (Şekil 1F) ağırlığındadır. 3. Cerrahi Steril cerrahi alanında hazırlayın. gerektiği gibi steril eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipman kullanın. bir otoklav araçları sterilize edin. 1.0 mM klor dioksit çözeltisi ile stereotaktik çerçeve sterilize edin. çerçeve üzerine çözelti püskürtünüz ve steril su ile yıkamadan önce 5 dakika bekleyin. implante headp sterilize etmek içinIECE parçaları, 1.0 mM klor dioksit çözeltisi ile bileşenlerin sprey ve steril su ile yıkamadan önce 5 dakika bekleyin. steril bir petri içine şimdi steril implante donanım yerleştirin. Daha sonra% 100 oksijen 1.5-2.0% izofluran ile 200 ml'lik bir indüksiyon odasında fare anestezi, fare için bir ameliyat öncesi ağırlığı elde. / Dakika yaklaşık 500 ml bölmesine bir akış hızını kullanarak. İndüksiyon odayı döndürmek suretiyle düzeltme refleksi kaybının kontrol edin. tamamen kulak çubukları ile farenin kafasını güvence olmadan stereotaktik çerçeve üzerinde burun konisi içine indüksiyon odası ve yerden fareyi çıkarın. Ayrıca vital bulguları değerlendirirken ayak tutam değerlendirme ile anestezi uygun derinlikte izlemek için devam edin. Böyle bir rektal prob ile ısıtma yastığı sistemi gibi bir kapalı döngü sıcaklık kontrolörü, 37 ° C 'de iç vücut ısısını korumak. kürk kapalı kırparak önce oftalmik göz merhemi ile fare gözleri Kapakkavisli makas veya makası kullanarak kafatasının üstünde. betadin baş dezenfekte edin ve betadin geçmeden önce tamamen kurumasını bekleyin. intraperitoneal sıvılarla birlikte analjezik ve antibiyotik uygulayın. 25 g bir fare için, 0.5 mg sefazolin, 0.125 mg meloksikam, 0.5 mi tuzlu su ve 2.5 ug buprenorfin q 4-6 saat prn. kafasına orta hat boyunca 250 ul% 0.25 bupivakain subkutan enjekte edilir ve fare hem de elmacık kemerler üzerine 100 ul% 0.25 bupivakain subkutan enjekte edilir. stereotaksik çerçeve fare sabitleyin ve kafatası maruz. stereotaksik çerçeveye stereotaksik kulak çubukları ile fare kafasını sabitleyin. Fare ayak tutam refleksi olmadığından emin olunduktan anestezi cerrahi düzleminde olduğundan emin olun. Kafatasının orta hat boyunca bir No. 11 atılabilir neşter ile birlikte 1.5-2.0 cm'lik kesi oluşturun. kesi gözler arasındaki başlayıp oksiputta için posterior devam edecektir. </ Li> Mikro kelepçeler ile yanal cildi yayarak kafatası maruz. anestezi cerrahi uçağı sağlayan bir konsantrasyona 2.0 den% izofluran konsantrasyonunu azaltmak, ancak% 100 oksijen daha düşük% 1.0 izofluran azaltmak yoktur. Ameliyat öncesi analjezi anestezi cerrahi derinliği sürdürmek için gerekli inhale anestezik miktarını azaltır ve daha hızlı iyileşme ve sağkalım sonuçlara yol açabilir. Kafatası ve matkap çapak delik Seviye. Bregma tanımlamak ve koordinat sisteminin orijinini olur bregmadan en stereotaktik koordinatları sıfır. Lateral / medial ekseninde kafatası seviye için bregmadan her iki yönde 1,50 mm yanal bir stereotaksik manipülatör kolunun bağlı bir tesviye probu hareket ve dorsal / ventral derinliği az 0,05 mm olduğunu teyit zaman sonda temas sol ve sağ kafatasının taraf. Not: Dorsal / ventral manipülatör ar 10 mikron çözünürlüğüDijital birlikte kullanılan m ekran tesviye kolaylaştırır koordinat. Bregma hakkında ön / arka ekseni Tesviye aynı tekniği izler. Bregma ve Lamda temas için ventral mesafe farkı da az 0,05 mm olmalıdır. enlemesine bir düzlem yere paralel olacak şekilde regüle her iki yönde de tamamlanana kadar kafatası ayarlayın. Bu fare beyin atlası görüldüğü gibi gerçek stereotaktik koordinatlar için izin verir. 20 stereotaksik matkap içinde 0.5 mm çaplı mikro matkap ucu ile, kafatasının iki yarısı üzerinde orta hatta yanal 1.00 mm 1.30 mm aralıklarla bregma 4.50 mm posterior 3.30 mm anterior matkap çapak delik. Elektrotların 2.30 mm lateral kolonlar için, 2.00 mm ön matkap çapak delik orta hattın her iki tarafında 1.30 mm'lik artışlarla bregma 4.50 mm posterior (Şekil 2) bregma. Bu dr için gerekli olan yüksek doğruluk ve hassasiyetIlling işlem dijital stereotaksik manipülatör kolunun 10 mikron kararı ile kolaylaştırılmıştır. Not: headpiece pimleri için için düzgün implante edilebilir, fare kafatası stereotaksik çerçevesinde yerine güvenli bir şekilde olması gerekir. kafatası delme işlemi sırasında hareket ederse, başlık ve çapak delik hiza meydana gelebilir. Kafa takımlarına implant. Düz forseps ile, göğüs EMG teller için EMG tel tünelleri hazırlamak. sağ ve sol EMG teller hem de arka deri ve kas arasındaki 2.5 cm yuva. pimleri önceden delinmiş çapak delikleriyle aynı hizada olacak şekilde kavisli bir forseps ile EEG tuğla manevra sonra ilk düz forseps ile oluşturulan boşluğa toraks ve servikal EMGS takın ve. headpiece üzerine hafif basınç uygulayın ve kafatası içine işaretçilerine kıpırdatmak. Aks çapının 0.46 mm 'dir. oje yalıtım, iğneler delinmiş çapak ho sıkıca uyacakles. o uygun eklenir kez başlık istikrarlı olacaktır. Nihai pozisyonlara EMG teller ayarlayın. diğer tarafta headpiece için aynı işlemi tekrarlayın. Diş çimento kullanarak yerine baş kısmını sabitleyin. çapraz bağlanma bileşiği ile metil metakrilat: 1 oranını, hem başlık parçaları yerine ayarlandığında, 1 karıştırın. o maruz kafatası, pim elektrotların tırnak cilalı parçaları ve EMG tellerin proksimal bölümünü kapsar, ancak headpiece kadın kapları kapsamaz şekilde karışımı uygulayın. kürk üzerinde çimento alamadım emin olun. Fare üzerine kapmak mümkün olacağını oluşturmak için çimento sırtlar için izin vermeyin. kuru çimento için yeterli zaman sağlanması ve daha sonra stereotaktik çerçeve fare kaldırmak. Fare taşımak zorunda kalacak toplam ağırlık headpiece 2 yarım olduğunu ve güvence çimento yaklaşık 1.2 gramdır. Temiz bir hayvan yerleştirinkurtarma alan. bir ısıtma yastığı ile iç vücut ısısını korumak. o anestezi çıkmasını simgeleyen, tüm postural refleksleri kavuşur kadar fare izleyin. Bireysel konut, uzun vadeli iyileşme için tavsiye edilir. cerrahi sonrası 3 gün en az günlük izleme girişimsel analjezi ile tavsiye edilir. kurtarma ameliyat sonrası 10-14 gün gergin alışma dönemi başlamadan önce izin verin. Tethering 4. alıştırarak Hayvanlar Bir fare baş desteğini (Şekil 1G-H) kullanılarak fare adaptörünü bağlayın. Fare ölçülü ve yavaş yavaş her iki tarafta implante headpiece içine adaptör işaretçilerine eklemek kez kavisli hemostatlarla yerine yapıştırılarak uygulanır başlık parçaları ters köşeleri üzerine tutun. Adaptörü (Şekil 1H) 32 kanallı amplifikatör bağlayın. Bir işbirliği içinde adaptörü ve amplifikatör hem logolar hizalamak için emin olunadaptör ve kanal haritalama hataları önlemek için amplifikatör hem nsistent yönelim. Bir RHD2000 standart seri çevresel arabirim (SPI) kablosuna amplifikatörü bağlayın. Bu kablo, sinyal kayıt için toplama sistemine bağlanır. bölme duvar üzerine monte konsol kolu olan bir bölme içinde fare yerleştirin. konsol koluna SPI arabirim kablosunu takın ve gergin kablo ağırlığını dengelemek için konsol kolunda gerginliğini ayarlamak. Fare serbestçe hareket edebilir ve kaydetmeden önce bir gün bir saat hafta habitüe edilir. Fare adaptörü kesmeden yardımcı olmak amacıyla bir yassı paslanmaz çelik mikro spatula kullanırken fareyi kesmek için, sadece fare kablosunu ve adaptörünü fişten çekin. 5. Sinyal Ekstraksiyon Sistem Kurulumu / Sinyal Kayıt implante fare headpiece içine inşa adaptörünü takın. adaptörü headstage amplifikatör bağlayın veamplifikatör ve satın alma kuruluna standart bir SPI arabirim kablosunu takın. farenin kafasına ek ağırlık en aza indirecek şekilde SPI kablosu düzgün gerilmiş konsol eklemek zorunda. Yerel bir Faraday kafesi yerleştirin headstage etrafında, iletken örgü veya alüminyum folyo kullanılarak oluşturulan ve yerel Faraday kafesi zemin. GUI modülü ile 30 kS / sn örnekleme hızı ve ölçü empedans seçerek her kaydın başlangıcından önce elektrot empedanslarından alın. veya daha az bir bireysel pin 10 k eşit bir empedans değeri uygun elektrot temas onayı için gereklidir. Yüksek empedans değerleri o elektrottan reddedilen verilere neden olur. kayıt için, Ritim FPGA, GUI Bandpass Filtresi ve LFP görüntüleyici bir sinyal zinciri oluşturmak. 1.00 kS / s, 0.1-7,500 Hz bant genişliğinin bir örnekleme oranını seçmek ve DSP seçimini kaldırmak için tavsiye edilir. 0,1-250 Hz Bant filtre ayarlayın ve op tarafından kanalları görüntülemekLFP görüntüleyici günler. En iyi seçilen beraberlik yöntemi ile 250 ve 400 mV kanal genlikleri verilerini görüntüler. GUI kullanarak kaydetmeye başlamak. Her kayıt için yeni bir klasör oluşturun ve bu klasöre dosyaları kaydetmek için yolunu ayarlamak. Bir Kayda başlamak için sadece rekor. konnektörü bütün 32 kanal varsayılan olarak kaydedilir, ancak istenmeyen kanallar kayıt başlamadan önce Ritim FPGA modülünün sağ tarafında tıklayarak seçilmemiş olabilir. analiz için Matlab içine veri alma. analizinde yardımcı olmak için kullanılabilecek açık kaynak toolbox çok sayıda vardır.