Mit hoher Dichte Elektroenzephalographische Acquisition in einem Nagetiermodell unter Verwendung von Low-Cost-und Open-Source-Ressourcen

Die Studien in dieser Untersuchung durchgeführt wurden, in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Pennsylvania genehmigt. 1. Überträger Design und Konstruktion Entfernen Sie jede achte Reihe von Stiften von der 2 x 50-Pin-Ziegel von einer 100 Position Aufnahmeverbinder mit einer Pinzette durch den Aufnahmebereich des Stiftes durch den Kunststoff Ziegel drücken. Hinweis: Pins nach unten weis wird die Ausrichtung, die für den Rest des Protokolls verwiesen wird. (Beachten Sie dies speziell in 2.6). Decken Sie die Stifte mit einer sehr dünnen Schicht Nagellack zu isolieren und der Nagellack vollständig trocknen lassen. Entfernen Sie den Nagellack von den Spitzen der Stifte mit Aceton und einem kleinen Tuch. Schneiden Sie die überschüssige Kunststoff des 2 x 7 ist mit einer Rasierklinge oder Drahterodieren pLiers. Dies wird in 2 x 7 Ziegel führen, die entlang der Länge der Stifte und exponiert an der Stiftspitze isoliert sind. Diese wird schließlich die transkranielle EEG-Elektroden. Zwei 2 x 7 Ziegel sind notwendig für eine vollständige chronischen Elektrodenanordnung (1A). Schneiden Sie zwei 1 x 2-Pin-Ziegel für EMG Signalaufzeichnung. Verwenden Sie den gleichen Prozess der Entfernung von unerwünschten Stifte mit einer Pinzette und das überschüssige Kunststoff Wegschneiden der 1 x 2 Ziegelsteine ​​zu erstellen. Stellen Sie sicher , dass diese 1 x 2 ist eine glatte Seite , um sie aus der ursprünglichen 100 Position Buchse haben , wie dieser Abstand die Standard – Stiftabstand für jedes Kopfstück werden wird so ein einzelner Adapter für alle Kopfbedeckungen (Abbildung 1A) arbeiten. Verwenden Sie 2-Komponenten – Epoxy die 1 x 2 – Pin – Stück mit dem 2 x 7 – Pin Stück (1D) zu befestigen. Da beide Sätze von Stiften in der gleichen Ausrichtung sein müssen, epoxy die 1 x 2 auf der lateralen Seite der beiden Hälften des Kopfstücks mit den glatten Seiten der 1 x 2 und 2 x7 miteinander in Kontakt. Richten Sie die 1 x 2 Pinholes und Stifte mit den posterior-most 2 Reihen von Stiften auf der 2 x 7. Anmerkung: Die beiden Hälften des Kopfstücks nicht miteinander epoxiert. Dies ermöglicht eine Flexibilität in den beiden Hälften des Kopfstücks Adapter zur leichteren Verbindung während Gewöhnung und während Versuchstage (Figur 1E). Lassen Sie die Kopfbedeckung Hälften über Nacht heilen. Nach der Fertigstellung wird das Kopfstück bilateral symmetrisch. Jede Hälfte besteht aus einem 2 x 7-Pin Backstein mit einem seitlich angebrachten 2 x 1 Stift Ziegel, die mit dem hinteren höchstens 2 Zeilen der 2 x 7-Pin Ziegel entspricht. Bereiten Sie Drähte für EMG Signalaufzeichnung. Einzelstrang, 31 G Perfluoralkoxy-isolierte Silberdraht wird für EMG – Signal – Aufzeichnung (1D) verwendet. Jedoch kann vielsträngigen oder andere Metallverdrahtung substituiert sein, falls gewünscht. So erstellen Brust-EMG Drähte nehmen ein 3,0 cm langes Stück Perfluoralkoxy isolierten Silberdraht und remove 1 cm von der Kunststoffisolierung von einem Ende mit einer Rasierklinge. Wickeln Sie das nicht isolierte Draht um eine Pinzette zweimal. Entfernen Sie den Draht aus der Pinzette und entfernen 25 mm Isolierung auf dem nicht geschleift Ende mit einer Rasierklinge. zervikalen EMG Drähte, wiederholen Sie den Vorgang mit einem 1,5 cm-Segment Draht zu konstruieren. Zwei zervikalen EMG Drähte und zwei Brust-EMG Drähte werden für einen kompletten Kopfstück benötigt. Entfernen Sie den seitlichen Stift in der am weitesten vorderen Reihe der beiden Kopfbedeckungen, die zu einer stereotaktischen Koordinaten von 3,3 mm vor der Bregma und 2,3 mm lateral von Bregma entspricht, da kein Gehirn unterhalb dieser Stelle ist als 20 durch eine Maus Gehirnatlas bestimmt (Abbildung 2A). Auf beiden Kopfstück Hälften, schneiden Sie die Stifte der 1 x 2 Ziegelstein auf den Kunststoffboden des Kopfstücks mit einem Paar Drahtschneider (3,0 mm von der Spitze des Stiftes) und der Hals EMG Draht an den vorderen Stift löten und der Brust EMG posterioren pim. Überprüfen Sie, dass jeder Stift elektrisch isoliert ist. Führen Sie eine Durchgangsprüfung mit einem Digitalmultimeter durch die beiden Leitungen des Voltmeters an verschiedenen Pins, während in der Kontinuität Modus verbindet. Galvanisch getrennte Stifte nicht ein akustisches Signal mit diesem Multimeter-Test erzeugen; jedoch elektrisch gekoppelt Stifte werden. Decken Sie die Lötstellen mit Nagellack und einmal trocken, biegen Sie die EMG Drähte, so dass sie parallel zu den vorderen / hinteren Achse mit minimaler seitlicher Verschiebung sind. Trim Stifte zu einer relativen Länge, so dass sie zusammenpassen, das Oberflächenprofil des Gehirns. Mit dem aide einer Maus Gehirnatlas, Oberfläche Rekord ventralen Abstand zu Gehirn von Bregma für jeden Stift zu koordinieren. 20 Der Stift , dessen ventralen Abstand von Bregma ist die größte wird als Indikator für Pin Trimmen dienen. Dieser Stift wird nicht beschnitten werden , während alle anderen Stifte werden in Bezug auf diese maximale ventralen Distanzstift (Tabelle 1 geschnitten werden). Hinweis: Die Pins werden kann geschliffen auf die richtige Größe, aber es muss die Stifte des Kopfstücks zu biegen kann vorsichtig als die Reibung zwischen dem Stift und der Schleifscheibe erfolgen verursachen. Wenn ein Stift verbogen ist, verwenden Pinzette es zu begradigen. Eine Alternative zu den Stiften Abschleifen auf Länge ist sie mit einem Paar Drahtschneider zu trimmen. Decken Sie alle der Stiftspitzen mit einer Silberlösung eine Silberlösung Stift und trocknen lassen. Dieser Schritt verringert Elektrodenimpedanzen ≤30 kOhm, die das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht, und eliminiert gleichzeitig die Ecken und Kanten von dem Stift verursacht Trimmen daher die Chancen von Gewebeschäden verringert und Erholung von der Operation beschleunigt wird. Ein ausgefülltes Kopfbedeckung Hälfte wiegt etwa 0,5 g. 2. Adapter Aufbau und Kanalzuordnung Schneiden Sie die Verbindungsdrähte eines 36 Position doppelreihig Male Nano-Miniatur-Steckverbinder auf eine einheitliche Länge von 2 oder 3 cm mit einer Rasierklinge. Für jeden Draht, stAbzocke 2,5 mm Isolierung vom Ende und Zinn die freiliegenden Metall für jeden Draht. Stellen Sie sicher, wenn eine einzige, dünne Strähne aus verzinnten Draht für jeden Nano Adapter Draht zu haben, Verzinnen, da dies von entscheidender Bedeutung ist Pins zu isolieren. Snip die abisoliert mit Drahtschneider (1C) aus. Erstellen Sie einen passenden Stecker / Stecker auf dem Kopfstück mit der Conn-Streifen Header 2 x 50 Cut zwei 2 x 7 ist und zwei 2 x 1 der aus einem 2 x 50 Ziegel. Entfernen Sie unerwünschte Stifte von der 2 x 50 Ziegel von einem der Steckerstifte abbrechen, und drücken Sie dann die ungebrochene zweiten Hälfte des gleichen Stückes aus dem Stecker mit einer Pinzette (Abbildung 1B). Hinweis: Die eine Seite dieser Stifte dienen als Adapterstifte in jedem Kopfstück zu stecken, während die andere Hälfte wird auf die verzinnten Nanoverbindungsdrähte angelötet werden. Achten Sie darauf, die flachen Kunststoff-Kanten der 2 x 1 und 2 x 7 berührend zu haben richtige Paarung der Stecker / Stecker-Stecker mit dem Kopfstück in Schritt erstellt zu garantieren1. Lötzinn auf einem der Boden / Referenzdrähte aus dem Nano-Anschluss auf den gewünschten Masse / Referenzstift. Boden und Referenzdrähte sind auf dem RHD2132 Verstärkerchip miteinander verbunden. Verwenden Sie ausschließlich den Stift, der 0,60 mm vor Bregma und 1,00 mm seitlich von Bregma sowohl als Referenz und Boden. (Linke Kopfstück, medialen Stift der dritten vordersten Reihe, jedoch könnte jede andere Stift zugeordnet werden , wenn bevorzugt, Figure 2.) Man beachte , dass es möglich ist , Boden zu trennen und Referenz auf dem Verstärkerchip durch den 0Ω Widerstand zu entfernen , die Masse bindet und Referenz zusammen, wenn die beiden Trenn gewünscht wird. Löten Sie die verzinnten Nanoverbindungsdrähte auf der gleichen Seite der Stecker / Stecker-Anschlüsse als Grund / Referenzstift-Verbindung. Jeder Draht Karten auf einen bestimmten Kanal, so kann Kanal-Setup zu diesem Zeitpunkt abgeschlossen sein. Kanalkartendiagramme für die Verstärker headstages sind am Open Ephys Wiki-Website gefunden (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Löten Sie den entsprechenden Draht, dessen Kanal mit dem entsprechenden Stift bekannt, dass die gewünschte Abbildung zu erzielen. Schneiden Sie nicht benutzten Adern an der Basis des Nano Stecker mit den Drahtschneider. Mit einem Voltmeter, um sicherzustellen, dass jeder Stift von allen anderen Pins elektrisch isoliert ist. Nach Isolierung bestätigt wird, gelten um jede Lötstelle eine dünne Schicht Nagellack weiter jeden Stift isolieren. Unter Verwendung von 2-Komponenten-Epoxy, verstärken die passende Nano-Adapter an den bilateralen 2 x 7 und 2 x 1 Stifte an den Stecker-Stecker Ziegeln. Hinweis: Es wird auf diese einzelnen Adapter zwei Hälften, die den Stift Anordnung der Kopfbedeckung Hälften passen zuvor erstellt haben. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, dass der mittlere Abschnitt jeder Hälfte des Adapters nicht überschüssiges Epoxidharz hat die Kunststoffkante der Stecker / Stecker-Stecker überfüllt, da diese beiden Hälften des Aufsatzes in gleichzeitig angeschlossen verhindert werden. Es darf kein Epoxid auf der Unterseite des Pin-Adapter por fließention des Adapters, da dies würde auch verhindern, dass richtigen Verbindungen. Verwenden Sie die 2 Kopfstück Hälften als Form für die richtige Steckerstift Ausrichtung. Epoxy beide Hälften des Adapters und Epoxy die Basis des Nano-Anschluss seiner Haltbarkeit zu erhöhen. Achten Sie darauf, alle Lötstellen mit Epoxy abzudecken. Lassen Sie den Adapter Heilung über Nacht. Bestätigung der richtigen Kanalzuordnung kann unter Verwendung von Impedanzmessungen durchgeführt in der Open-Ephys grafische Benutzeroberfläche (GUI). Ein ausgefülltes Adapter wiegt ca. 1,3 g (1F). 3. Chirurgie Bereiten Sie einen sterilen OP – Bereich. Tragen Sie sterile Handschuhe und andere persönliche Schutzausrüstung erforderlich. Sterilisieren Werkzeuge in einem Autoklaven. Sterilisieren Sie den stereotaktischen Rahmen mit einer 1,0 mM Chlordioxid-Lösung. Sprühen Sie die Lösung auf den Rahmen und warten Sie 5 Minuten, bevor sie mit sterilem Wasser gespült. Um sterilisieren implantierbare headpIECE Teile, sprühen die Komponenten mit einem 1,0 mM Chlordioxid-Lösung und 5 min warten, bevor sie mit sterilem Wasser gespült. Legen Sie das jetzt sterile implantierbare Hardware in eine sterile Petrischale. Besorgen Sie sich eine präoperative Gewicht für die Maus, dann betäuben die Maus in einem 200 ml Induktionskammer unter Verwendung von 1,5-2,0% Isofluran in 100% Sauerstoff. Verwenden Sie eine Durchflussrate in die Kammer von etwa 500 ml / min. Bestätigen Verlust Reflex der aufrichtenden die Induktionskammer durch Drehen. Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer und Ort in die Nase Kegel auf dem stereotaktischen Rahmen, ohne vollständig die Maus den Kopf mit den Ohrstangen sichern. Weiter für die richtige Tiefe der Anästhesie durch toe Prise Beurteilung zu überwachen, während auch Vitalfunktionen zu beurteilen. Aufrechterhaltung Körperkerntemperatur bei 37 ° C mit einem Closed-Loop Temperaturregler, wie beispielsweise einer rektalen Sonde und Heizkissen System. Decken Sie die Augen der Maus mit Augenaugensalbe, bevor das Fell Abschneidenauf der Oberseite des Schädels einer gebogenen Schere oder Clippers verwenden. Desinfizieren Sie den Kopf mit Betadin und lassen Sie den betadine vollständig trocknen, bevor Sie fortfahren. Verabreichen Analgetika und Antibiotika zusammen mit Flüssigkeiten intraperitoneal. Für eine 25 g-Maus, 0,5 mg Cefazolin, 0,125 mg Meloxicam, 0,5 ml Kochsalzlösung und 2,5 ug Buprenorphin q 4-6 h prn. Inject 250 ul 0,25% Bupivacain subkutan entlang der Mittellinie auf dem Kopf, und spritzen 100 ul 0,25% Bupivacain subkutan auf beiden Jochbeine der Maus. Sichern Sie die Maus in die Stereotaxierahmen und den Schädel aus. Sichern Sie den Kopf der Maus mit den Stereotaxierahmen Ohr Stangen an der Stereotaxierahmen. Stellen Sie sicher, dass die Maus an einer Operationsebene der Anästhesie wird durch das Fehlen des Zehen pinch reflex bestätigt. Erstellen Sie ein 1,5-2,0 cm Einschnitt zusammen mit einem No. 11 Einweg-Skalpell entlang der Mittellinie des Schädels. Der Schnitt wird zwischen den Augen beginnen und nach hinten mit dem Okziput weiter. </ Li> Expose den Schädel durch die Haut seitlich mit Mikroklammern zu verbreiten. Reduzieren Isofluran Konzentration von 2,0% bis zu einer Konzentration, die eine chirurgische Anästhesie Ebene beibehält, aber nicht verringern, um weniger als 1,0% Isofluran in 100% Sauerstoff. Die präoperative Analgesie reduziert die Menge des inhalierten Narkose benötigt, um eine chirurgische Narkosetiefe zu halten und kann zu einer schnelleren Erholung und einem verbesserten Überleben Ergebnissen führen. Stufe der Schädel und bohren Bohrlöcher. Identifizieren Bregma und Null, um die stereotaktischen Koordinaten bei Bregma, die den Ursprung des Koordinatensystems wird. Um den Schädel in der medialen / lateralen Achse, also eine Nivellierung Sonde bewegen an einem stereotaktischen Manipulatorarm 1,50 mm seitlich in beiden Richtungen von Bregma und bestätigen, dass die dorsale / ventralen Tiefe weniger als 0,05 mm, wenn die Sonde in Kontakt mit der linken und der rechten Seiten des Schädels. Hinweis: Die 10 & mgr; m Auflösung des dorsalen / ventralen Manipulator arin Verbindung mit einem digitalen benutzten M Koordinatenanzeige Nivellierung vereinfacht. Nivellierung der anterioren / posterioren Achse, um Bregma folgt die gleiche Technik. Der Unterschied in der ventralen Abstand zum Kontaktieren Bregma und Lamda sollte auch weniger als 0,05 mm. Stellen Sie den Schädel bis Nivellierung in beiden Richtungen komplett ist, so daß die Querebene zu dem Boden parallel ist. Dies ermöglicht eine echte stereotaktischen Koordinaten , wie in den Maus – Gehirnatlas gesehen. 20 Mit einem Durchmesser von 0,5 mm Mikrobohrer in einem stereotaktischen bohren, bohren Bohrlöcher von 3,30 mm vor bis 4,50 mm hinter Bregma in 1,30-mm-Schritten auf 1,00 mm seitlich der Mittellinie auf beiden Hälften des Schädels. Für die 2,30 mm seitlichen Spalten von Elektroden, bohren Bohrlöcher von 2,00 mm vor Bregmas bis 4,50 mm hinter Bregma in 1,30 – mm – Schritten auf beiden Seiten der Mittellinie (Abbildung 2). Die hohe Genauigkeit und Präzision, die für diesen dr erforderlich istIlling Operation wird durch die 10 & mgr; m Auflösung einer digitalen stereotaxische Manipulatorarm vereinfacht. Hinweis: Um für die Stifte des Aufsatzes richtig implantiert zu werden, muss der Schädel der Maus sicher innerhalb des Stereotaxierahmen vorhanden sein. Wenn der Schädel während des Bohrens bewegt, Fehlausrichtung der Kopfbedeckung und Bohrlöcher erfolgen kann. Implantieren Sie die Kopfbedeckungen. Mit geraden Zange, bereiten EMG Kabelschächte für die Brust-EMG Drähte. Eingraben 2,5 cm zwischen der Haut und Muskeln in der Rückseite sowohl für den linken und rechten EMG Drähte. Legen Sie die Brust- und Gebärmutterhalskrebs EMGs in die mit den geraden Zange gebildeten Hohlraum zuerst, und dann manövrieren die EEG-Ziegel mit einer gebogenen Pinzette, so dass die Stifte mit den zuvor gebohrten Bohrlöchern auszurichten. Mit leichtem Druck auf das Kopfstück und wackeln die Stifte in den Schädel. Bolzendurchmesser beträgt 0,46 mm. Mit isolierenden Nagellack, passen die Stifte fest in das gebohrte Grat holes. Das Kopfstück wird stabil sein, wenn es in geeigneter Weise eingesetzt wird. Stellen Sie EMG Drähte bis zur endgültigen Positionen. Wiederholen des gleichen Verfahrens für das Kopfstück auf der anderen Seite. Sichern Sie das Kopfstück an Ort und Stelle unter Verwendung von Zahnzement. Wenn beide Kopfbedeckungen an Ort und Stelle festgelegt sind, mischen Sie 1: 1-Verhältnis von Methylmethacrylat mit seiner Vernetzungsverbindung. Die Mischung, so daß sie den freiliegenden Schädel, Nagelpolierten Teile der Stiftelektroden und proximalen Abschnitt des EMG Drähte bedeckt, aber die Buchsenleisten des Kopfstückes nicht abdeckt. Achten Sie darauf, nicht Zement zu bekommen auf Pelz. Lassen Sie nicht für Rippen von Zement zu bilden, dass die Maus Lage sein wird, auf zu greifen. Achten Sie darauf, genügend Zeit für den Zement zu trocknen, und entfernen Sie die Maus aus der stereotaktischen Rahmen. Das Gesamtgewicht, das die Maus aus den zwei Hälften des Aufsatzes und der Sicherungs Zement beträgt ca. 1,2 g zu tragen haben wird. Legen Sie das Tier in einem sauberenWiederherstellungsbereich. Pflegen Sie die Körperkerntemperatur mit einem Heizkissen. Überwachen Sie die Maus, bis es alle Haltungsreflexe wiedererlangt, was bedeutet, Austritt aus der Narkose. Individuelle Gehäuse ist für den langfristigen Erholung zu empfehlen. Tägliche Überwachung für mindestens 3 Tage nach der Operation wird mit der interventionellen Analgesie empfohlen. Lassen Sie 10-14 Tage der Erholung nach der Operation, bevor sie eine tethered Eingewöhnungszeit zu starten. 4. habituate Tiere zu Tethering Schließen Sie den Adapter mit der Maus eine Maus Kopfstütze (Abbildung 1 G-H). Halten Sie auf den gegenüberliegenden Ecken der Kopfbedeckungen, die an Ort und Stelle mit gebogenen hemostats zementiert werden, sobald die Maus zurückgehalten wird und langsam die Adapterstifte in die implantierten Kopfstück auf beiden Seiten einsetzen. Verbinden Sie den 32 – Kanal – Verstärker mit dem Adapter (Abbildung 1H). Seien Sie sicher, dass die Logos auf den Adapter und Verstärker in einem Co auszurichtennsistent Orientierung sowohl für den Adapter und dem Verstärkerkanal-Abbildungsfehler zu vermeiden. Schließen Sie den Verstärker an einen RHD2000 Standard Serial Peripheral Interface (SPI) Kabel. Dieses Kabel wird an das Erfassungssystem für die Signalaufzeichnung verbinden. Platzieren Sie die Maus in einer Kammer, die einen Ausleger installiert an der Kammerwand hat. Bringen Sie die SPI-Schnittstellenkabel an den Auslegerarm und stellen Sie die Spannung in dem Auslegerarm das Gewicht des angebundenen Kabel entgegenzuwirken. Die Maus ist in der Lage, frei zu bewegen und wird für eine Stunde pro Tag in der Woche gewöhnte vor der Aufnahme. Um die Maus zu trennen, ziehen Sie einfach das Kabel und Adapter aus der Maus, während eine flache Edelstahl Mikro Spachtel zum Adjutanten mit in den Adapter aus der Maus zu trennen. 5. Signal Extraction System-Setup / Signalaufzeichnung Stecken Sie den konstruierten Adapter in das Kopfstück einer implantierten Maus. Verbinden eines heads Verstärker an dem Adapter undeine Standard-SPI-Interface-Kabel an den Verstärker und an den Erfassungsplatine befestigen. Lassen Sie die SPI-Kabel an einen richtig gespannt Ausleger befestigen, so dass das zusätzliche Gewicht auf dem Kopf des Maus minimiert wird. Legen Sie einen lokalen Faraday-Käfig, erstellt leitende Gitter oder Aluminiumfolie, um die heads und erden Sie die lokale Faradayschen Käfig. Erhalten Elektrodenimpedanz vor Beginn jeder Aufzeichnung durch einen 30 Auswahl kS / s Abtastrate und messen Impedanzen über das Modul in der GUI. Ein Impedanzwert von weniger als oder gleich 10 k & OHgr; für einen einzelnen Stift ist für die Bestätigung der richtigen Elektrodenkontakt erforderlich. Höhere Impedanzwerte führen zu abgelehnten Daten von dieser Elektrode. Für die Aufnahme einer Signalkette von Rhythm FPGA, Bandpass-Filter, und LFP-Viewer in der GUI erstellen. Es wird empfohlen, eine Abtastrate von 1,00 kS / s, die Bandbreite von 0.1-7,500 Hz und deaktivieren DSP auszuwählen. Stellen Sie den Bandpassfilter auf 0,1 bis 250 Hz und zeigt die Kanäle von opEning den LFP-Viewer. 250 und 400 & mgr; V-Kanal-Amplituden mit Methode lost am besten visualisiert die Daten. Beginnen Sie mit der GUI-Aufnahme mit. Erstellen Sie einen neuen Ordner für jede Aufnahme und stellen Sie den Pfad für Dateien in diesem Ordner zu speichern. Um eine Aufnahme zu beginnen drücken Sie einfach aufzeichnen. Alle 32 Kanäle aus dem der Anschluss sind standardmäßig aufgezeichnet, aber unerwünschte Kanäle können durch einen Klick auf die rechte Seite des Rhythm-FPGA-Modul vor dem Beginn der Aufzeichnung nicht ausgewählt werden. Importieren von Daten in Matlab für die Analyse. Es gibt eine Vielzahl von Open-Source Werkzeugkästen die verwendet werden können in der Analyse zu helfen.