Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Yipu Lin; Yan Gu; John W. McCauley

doi:10.3791/54897

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

İmmünoloji ve Enfeksiyon

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

Published: December 14, 2016

doi:

10.3791/54897

Yipu Lin¹, Yan Gu¹, John W. McCauley¹

¹Mill Hill Laboratory,The Francis Crick Institute

Özet

이 연구는 설명 영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

Abstract

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Introduction

마이크로 중화 (MN) 분석은 중화 항체의 정량과 항 바이러스 활동 바이러스학에 사용됩니다. 혈구 응집 억제의 대안으로 (HI) 분석, MN의 분석은 HI의 해석은 ^{1,2,3 결과} 복잡하게 수용체 결합 인플루엔자 바이러스에의 선호도 변화에 의해 영향을 비 항원 효과를 극복 할 수있다. 최근까지 대부분의 MN의 분석은 세포 변성 효과 (CPE) 또는 효소 면역 분석법 (ELISA) ^4,5 기반으로했다. 초점과 플라크 감소에 따라 MN 분석 1990 년 ^6,7,8 개발되었다. 플라크 감소 분석은 감염을 정량화 볼 수 플라크를 계산에 의존하고 있습니다. 그러나, 시각 카운트는 플라크의 대부분이 작은 많은 현재의 순환 바이러스에 대한 눈에 보이지는 않지만 인간의 눈으로 확인할 수있는 큰 플라크를 다룹니다. 이 불완전한 정보에 따르면 내가 선도, 심사관들과 실험 사이에 상당한 변화를 일으킬 수 있습니다ncomparable 결과. 또한 일부 바이러스는 단일 세포 또는 매우 작은 플라크 불현성 감염을 표시 할 때 방법을 사용하는 것도 불가능하다.

가난한 계수 해상도 이미징 기반 프로토콜을 도입함으로써 개선 될 수있다. 기술, 광학 현미경 및 높은 처리량의 발전과 함께 잘 플레이트 리더는 감염된 세포 ^구를 계산하는 정확한 방법을 제공 할 수 있습니다. 트랜스 조명 현미경, 특정 마커 태그 감염된 세포는 서브 세포 해상도에서의 흡수 또는 형광 대조적으로 시각화 할 수있다. 시료 후 컴퓨터 화면에서 분석 될 수있다.

불행히도 인해 시야의 제한으로 100 개 이상의 타일 이미지는 하나의 웰을 포함해야한다. 96 웰 플레이트로 분석하면 약 만 화상의 화상 처리를 필요로한다. 이러한 힘든 과정은 시간이 걸리고 비싸다하고 얻은 해상도는 장군에바이러스 감염의 일상적인 특성에 대한 불필요한 리터. 제한된 예산 연구소는 평판 스캐너 중심으로 구축 접근 방식은 비용 효과, 높은 처리량 대안을 제공하는 것을 알 수 있습니다.

본 논문에서는 바이러스의 많은 수의 항원 특성에 대한 정량적 항 바이러스 활동 및 중화 항체를 측정하기에 적합한 개선 된 플라크 감소 MN 분석에 대해 설명합니다. 분석은 여러 가지 장점이있다 : 첫째, 상관없이 플라크 크기, 세포 수준에서 바이러스 감염을 측정 할 수있는 영상 기반 분석법이다. 잘 내 총 감염된 세포 집단 (ICP)를 계산하는 것은 대단히 가능한 낮은 감염으로 바이러스를 특성화 할 수있게, 검출 감도를 증가시킨다. 둘째,보다 정확한 정량 적정 입력 된 바이러스의 양을 결정하기 위해 중화하기 전에 도입된다. 정량적 입력 바이러스는 상당히 감소 바리다른 실험 사이 기는 실험실의 결과는 더 비교할 수 있습니다. 셋째, 중화 역가를 이미지 분석을 빠르게 정량을 사용자 친화적하여 결정될 수있다. 마지막으로, 프로토콜은 필요한 해상도와 정확도를 비용 효율적이고 높은 쓰루풋의 대안을 제공한다. 정량은 평판 스캐너 무료 데이터 처리 소프트웨어를 기반으로합니다. 전체 설치는 작은 풋 프린트를 가지고 있으며, 대부분의 실험실에서 배포합니다.

이 논문에 제시된 프로토콜은 바이러스 적정, 적정 정량, 바이러스 중화, 중화 정량 등 4 개 주요 단계로 구성되어 있습니다. 바이러스 적정 입력 된 바이러스의 양이 중화에 사용하는 결정 제제 실험이다. 적정 기간 동안, 바이러스 농도의 숫자가 96 웰 플레이트에서 세포 단층에 적용된다. 감염된 세포는 다음 섹션 2. 바이러스 dilu에 정량된다20 %에게 -85 %를 생산 능은 ICP 차례에 대응하는 중화에 입력 바이러스와 같은 적용 섹션 3. 중화 프로토콜의 역가가 섹션을 위의 프로토콜이 대표 결과에 제시되어 다음 4. 실험을 사용하여 정량한다. 분석은 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 형 바이러스와 같은 현재의 순환 인플루엔자 바이러스의 대부분과 함께 지난 2 년 동안 철저하게 테스트되었습니다. 인플루엔자 바이러스의 특성 분석의 결과는 2016 년 남반구와 2016에서 2017 사이에 북반구에 사용되는 인플루엔자 백신에 대한 권장 사항을 준 WHO 상담 회의의 보고서에 포함되었다.

Protocol

참고 : 다음 프로토콜에 대한 바이오 안전성 수준 (BSL)은 잠재적 인 유행성 독감 바이러스에 대한 계절 인플루엔자 바이러스 및 BSL 3+위한 BSL 2입니다. 바이러스 적정 바이러스 제어 (VC)의 바이러스 농도를 결정하기 위해 중화 실험에 앞서 요구된다. 1. 바이러스 적정 주 : (1) 바이러스 희석 행 또는 열 (도 1) 중 하나를 따라 배치 될 수 바이러스의 수와 중복 수에 따라이 잘 플레이트는 다음의 유연성으로 설정 될 수있다. 각각의 바이러스는 별도의 행 / 열을 차지한다. (2) 바이러스 희석 증가는 유연하지만, 왼쪽 상단에서 가장 높은 바이러스 농도로 시작한다. (3)의 중복의 개수에는 제한이 없다. 참고 : Madin 다비 개 신장 (MDCK) 및 MDCK-SIAT1 (SIAT) 세포는 친절 박사 M. Matrosovich, 마르부르크, 게르에 의해 제공되었다10 많은. SIAT 세포는 안정적으로 인간의 CMP-N-acetylneuraminate로 형질 MDCK 세포이다 : 시알 산 (SA)의 강화 된 표현을위한 β – 갈 락토의 α-2,6- 시알 산 전이 효소 유전자 α2-6Gal 종료 올리고당. 분취 충분한 MDCK 세포 또는 MDCK 세포 SIAT-8 96 웰 플레이트에 (/ 웰 200 μL). 합류점에 도달하는 2 또는 3 일 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 10 % 열 – 불 활성화 소 태아 혈청 (FCS) 및 항생제 (100 U / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg의)이 보충 된 DMEM에서 세포를 전파. 5 % CO 2 및 1 ㎎ / ㎖의 G418 설페이트 37 ° C에서 SIAT 세포를 인큐베이션. 주 : 희석 배수 경험과 사용 된 세포주에 따라 달라집니다. 세포 단층은 컨 플루 언트해야합니다 (즉, 아니 세포 벽 또는 MDCK 세포와 MDCK-SIAT1 세포 단단히 포장 레이아웃을 볼 수 개요) 바이러스 접종시. 희석액의 예에 기초MDCK 또는 MDCK-SIAT1 세포의 합류 플라스크의 하위 문화는 표 1에 제시되어있다. 물론 당 바이러스 성장 매체 (VGM) 200 μL와 세포를 3 회 반복한다. 30 분 동안 70 % EtOH로 다중 벽 플레이트 세척 소독 후 세척 전에 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 또는 VGM에 린스. VGM을 대기음 즉시 각 웰에 VGM의 50 μl를 추가합니다. (테스트 바이러스 및 중복의 수에 따라 이하) 6 멸균 튜브에 각각 VGM의 900 μl를 추가합니다. 각 희석 사이의 팁을 변경, 희석 직렬, 제 1 튜브에 바이러스의 100 μl를 피펫 잘 혼합합니다. 각각의 바이러스에 대해 반복하는 것이 적정합니다. 참고 :이 10-6로 10-1의 바이러스 희석을 줄 것이다. 가장 높은 희석에서 시작하여, 각각의 바이러스 희석의 50 μl를 추가 9의 중복 우물 (그림 1의 열 9, 10) 내지 (그림 1의 1 × 10-5)6 웰 플레이트. 바이러스는 세포를 감염시킬 수 2-3 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 놓는다. 참고 : 2 ~ 3 시간 배양은 접종에서 바이러스가 단일 층에 도달 할 수있는 충분한 시간이 있는지 확인하는 것이 필요하다. 오버레이를 준비 (10 ㎖ / 판) 참고 : 오버레이 2 배 DMEM, 트립신 (2 μg의 / ml의 최종 농도), (20) 1 ㎎ / ㎖ 주식의 μL, 셀룰로오스 코튼 린터 5 ㎖ (재료 목록 참조) 5 ㎖로 구성되어 있습니다. 접종을 제거합니다. 오버레이 (각 웰에 200 μL)를 추가합니다. 방해받지 않고, 37 ° C에서 밤새 품어. 주 : 바이러스 발아 후 약 4 시간 일어난다 그래서 플레이트가이 시간 이후에 방해되지 않는 것이 중요하다. 우물에서 오버레이를 대기음. PBS (A)에 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드를 추가 (200 μL / 웰). 30 분 동안 또는 20 분 동안 실온에서 4 ° C에서 그들을 놓는다. 참고 : PBS A는 10 이동과 자연의 pH 인산 완충 식염수입니다F의 NaCl, 0.25 g의 KCl, 나 2 HPO 4 1.437 g, KH 2 PO 4, 0.25 g, 증류수 1 L (재료 목록 참조). 참고 : 흡입 및 삼키면 화상을 입을 수 있습니다 때 파라 포름 알데히드는 유해하다. 이 발암 성 영향이 제한된 증거도이며, 피부 접촉 후 과민성을 일으킬 수 있습니다. 파라 포름 알데히드를 기음과 PBS A를 두 번 접시를 씻어 (200 μL / 웰). 향후 사용을 위해 4 ° C에서 PBS A의 판을 보관하거나 다음 단계를 계속한다. permeabilization 버퍼를 추가 (100 μL / 웰). 30 분 동안 실온에서 그것을 둡니다. PBS A를 두 번 접시를 씻으 (200 μL / 웰). 물론 당 (ELISA 버퍼 1,000 1) 첫 번째 항체의 50 μL, 인플루엔자 A 형에 대한 마우스 단클론 항체를 추가합니다. 진탕, 1 시간 (또는 4 ℃로 하룻밤) 실온에서 그것을 품어. 세척 완충액 (0.05 % 트윈 80 PBS A, V / V IN) 페이지 100 ㎕에 3 회 반복한다잘 어. 세척과 5 분 동안 실온에서 인큐베이션을. 또는, 잘 300 μl를 사용하여 배양하지 않고 3 회 씻는다. 두 번째 항체의 50 μl를 추가, 염소 항 – 마우스 IgG (H + 1) HRP 접합체 (1 : ELISA 버퍼 1,000), 당 잘. 진탕하면서, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하여. 단계 1.17에 설명 된대로 3 회 반복한다. 기판 (50 μL / 웰)를 추가합니다. 30 분 동안 또는 청색의 발색 분명히 보일 때까지 상온에서이를 부화. 세척 사이 2-3 분 동안 실온에서 배양하고, 반응을 정지 웰 당 증류수 200 μL 회 플레이트를 세척한다. 접시를 공기 – 건조하고 어두운 장소 (예를 들면, 알루미늄 호일에 포장)에 저장합니다. 2. 적정 정량 도 2a에 도시 된 바와 같이, 플랫 베드 스캐너의 스캔 영역에서 웰 플레이트를 놓는다. 의 L 자형의 위치 제한을 사용최적의 및 반복적 인 영상 위치를 확인합니다. 참고 : 하나의 스캔 이미지이 잘 접시에 가능하다. 이미지를 스캔합니다. 참고 :이 설정은 표 2에 나타내었다. 필요한 바이러스 농도 (그림 3)을 계산하기 위해 "Wellplate 리더"소프트웨어를 실행합니다. 이미지를로드하려면 "이미지로드"버튼을 클릭합니다. 샘플링 임계 값을 조정하는 "글로벌 임계 값"탭의 막대 그래프에서 빨간색 막대를 밀어 넣습니다. 이미지에 미치는 영향을 조사하기 위해 "업데이트"버튼을 클릭합니다. 은 "계산 중화 / 적정"상자을 선택합니다. 유도 결합 플라스마를 정량화 할 수있는 "샘플링"버튼을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 샘플링 결과를 저장하기 위해 "저장"버튼을 클릭합니다. 참고 : "계산 중화 / 적정"상자가 체크되어있는 경우 샘플링 과정 후, "중화 및 적정 계산"이라는 새로운 창이 자동으로 나타납니다. 부하 또는 입력 잘 플레이트 정의지도. "최적의 바이러스 인구 (%) 적정"의 임계 값 (예 : 30 %)을 나타냅니다. 적정 결과를 계산하기 위해 "적정 프로세스"탭을 선택합니다. 적정 결과를 확인합니다. 적정 결과를 저장하기 위해 "저장 후 닫기 '버튼을 클릭합니다. 주 : 소프트웨어에 대한 자세한 설명서에 대한 보충 S1을 참조하십시오. 주문 된 소프트웨어의 사본은 요청에 따라 사용할 수 있습니다. 참고 : 일반적으로, 각 웰 (11)에서 50 % (20-85%) 총 세포의 ICP 주위에 플라크 감소 분석 수익률에 가장 적합한 바이러스 희석. 3. 바이러스 중화 주 : 중화 분석에 필요한 판의 수를 계산한다. 각 플레이트 한 바이러스 및 항혈청들을 수용 할 수있다. 주 : 항혈청의 개수 및 중복 수에 따라 웰 플레이트 번째로 설정 될 수있다예 다음은 유연성 (1) 혈청 희석 하나의 행 또는 열 (도 4)을 따라 배치 될 수있다. 각 혈청은 별도의 행이나 열을 차지한다. (2) 혈청 희석의 증가는 유연하지만 플레이트의 좌측 상단에 최고 혈중 농도로 시작한다. (3)의 중복 횟수는 항혈청의 수가 균형. 더 많은 중복 실험적인 변화를 부드럽게하는 데 도움이 될 수 있습니다. (4) VC의 수와 셀 제어 (CC) 중복 유연하지만, 또한 별도의 행 또는 열이어야 수. VC 중복 수가 항혈청보다 훨씬 큰 것으로 예상된다. 에서 미리 1.1-1.3, 2, 3 일 단계로, 세포 단층을 준비한다. 플레이트의 각 웰에 VGM의 50 μl를 추가합니다. 각각 VC와 CC에 대한 열 11, 12을 사용합니다. 콜럼의 첫 번째 행 (A) 1:20 수용체 파괴 효소 (RDE) 처리 된 혈청 50 ㎕를 분취 추가NS 1-10. 주 : 각 바이러스 혈청 조합의 경우, 분석은 이중으로 수행되기 때문에, 하나의 플레이트는, 예를 들어, 바이러스가 다섯 항혈청에 대해 테스트를 포함 할 수있다. 행 H.에서 50 μl를 (그림 4 열 1 ~ 10) H를 행에 행 A로부터 50 μl를 전송 및 폐기함으로써 연속 희석을 2 배 수행 공통 열 (그림 4 열 12)의 각 웰에 희석 50 μl를 추가합니다. 공통 열을 제외하고, 플레이트의 각 웰에 바이러스의 50 μl를 추가합니다 (열 1-11, 그림 4의 행 AH)를. 2-3 시간 동안 37 ℃로 인큐베이션. 접종을 제거합니다. 물론 각 오버레이 (200 μL)를 추가합니다. 방해받지 않고, 37 ° C에서 하룻밤을 품어. 수정 및 바이러스 적정 (1.11-1.22 단계)에 관해서 판을 얼룩. 4. 중화 정량화 Figu 같이 평판 스캐너의 스캔 영역에서 웰 플레이트를 놓고2A 다시. 최적하고 반복 촬상 위치를 확인하기 위해 L 자 형상의 위치 제한을 사용한다. 참고 : 하나의 스캔 이미지이 잘 접시에 가능하다. 단계 2.2에 설명 된대로 판을 스캔합니다. 필요한 바이러스 역가 (그림 3 단계 2.3)를 계산하기 위해 "Wellplate 리더"소프트웨어를 실행합니다. 이미지를로드하려면 "이미지로드"버튼을 클릭합니다. 샘플링 임계 값을 조정하는 "글로벌 임계 값"의 빨간색 막대를 밀어 넣습니다. 효과를 검토하기 위해 "업데이트"버튼을 클릭합니다. 은 "계산 중화 / 적정"상자을 선택합니다. 유도 결합 플라스마를 정량화 할 수있는 "샘플링"버튼을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 샘플링 결과를 저장하기 위해 "저장"버튼을 클릭합니다. 참고 : "계산 중화 / 적정"상자가 체크되어있는 경우 샘플링 과정 후, "중화 및 적정 계산"이라는 새로운 창이 자동으로 나타납니다. 잘 페이지로드 또는 입력늦은지도. 의 임계 값 (예를 들어, 50 %)를 나타냅니다 "중화 :. 감염 공제 (%)를" 역가를 계산하기 위해 "중화 프로세스"를 선택합니다. 역가를 확인하고 중화 결과를 저장하기 위해 "저장 후 닫기 '버튼을 클릭합니다. 주 : 중화는 VC 대하여 소정 ICP 환원 (예컨대 50 % 나 80 % 등) (도 4의 열 (11)의 평균)과 혈청의 한 최고 희석액의 역수로서보고된다. 50 % ICP 감소는 대표적인 결과를 사용 하였다.

Representative Results

위의 절차에 따라, 우리는 최근의 항원 특성 실험에서 어떤 결과를 제시한다. 적정 설치는 각각의 희석에 대한 이중 중복으로, 8 개의 입력 바이러스를 검사하도록 설계되었습니다. 바이러스 희석 바이러스의 변형을 다루 -6 1.0 × -1 10 × 1.0 내지 1.0 시험 하였다. 테스트 바이러스는 A / 카메룬 / 15V-2,015분의 3,538을 포함하여 H3N2 아형, 출신 A / 블라디보스톡 / / 2015 (36), A / 모스크바 / A / 톰 스크 / 5 / 2015 / A / 모스크바 / 2,015분의 101 (103) / 2015 A / 모스크바 / / 2015 (100), A / 모스크바 / / 2015 (133), 및 A / 브라 티 슬라바 / 2,015분의 437. 적정 결과를도 5에 도시되어있다. 도 5d는 바이러스 희석 증가를 ICP의 감소를 보여준다. 곡선이 잘 (12) 내의 모든 세포에서 감염을 굴복 같은 바이러스를 ICP에 대해 정규화 된 (ICP 포화로 정의). 유도 결합 플라스마는 인사와 함께 포화에 도달하지 않은 경우ghest 바이러스 농도는, 대응하는 중복의 ICP 평균 대신 사용되었다 (A / 모스크바 / / 2015 103도 5D에서). ICP 포화도의 30 %를 생산하는 바이러스 희석 중화 (표 3)에 대한 입력의 바이러스 희석으로 선택 하였다. 중화 각 접시에 두 번 중복으로 다섯 항혈청에 대해 하나의 입력 바이러스가하는 것을 목표로. 표시 기준 바이러스는 H3N2 A / 스톡홀름 / 2,015분의 63입니다. 다섯 항혈청은 A / HK 14분의 4,801 계란 F12 / 15, A / HK 14분의 7,295 MDCK의 F02 / 15, A / 남아프리카 공화국 R2665 / 15 SIAT의 F50 / 15, A / 스위스 13분의 9,715,923 SIAT NIBF의 F18 / 15, 및 A / 네덜란드 14분의 525의 SIAT F23 / 15. 중화 결과는도 6에 도시되어있다. 그림 6D는 혈청 희석의 증가와 감염의 진행 상황을 보여줍니다. 수직축 정규화 양 인구 평균 ICP 대하여 해당 항혈청 응답으로부터 ICP와의 비를 나타낸다기준 (12)의 바이러스. 감염되지 않은 세포 컨트롤에서 배경 ICP는 정상화시 차감되었습니다. 중화 역가는 50 % ICP 감소 (표 4)에 대응하는 항혈청 희석액의 역수로서 결정 하였다. 선형 보간은 두 개의 인접한 혈청 희석액 사이 떨어지는 역가를 추정하는데 사용 하였다. 그림 1 : 바이러스 적정 실험에서 잘 플레이트 설치의 예. 테스트 바이러스는 별도의 행 (H에 A)에 할당됩니다. 열은 다른 바이러스 성 희석 (12-1)을 위해 설계되었습니다. 두 열은 각각의 바이러스 희석 중복 사용 하였다. 스케일 바 = 10 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = "1"> 도 2 : 샘플 스캐닝 시스템의 회로도. (a)는 플랫 베드 스캐너의 촬상 위치에있는 96 웰 플레이트 (로부터 재발행 엘스 비어 BV 허가) 11를 참조하고, (b)에 도시하는 L 자형 리미트 치수 (a). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : "Wellplate 리더"정량 소프트웨어의 바탕 화면도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </p> 그림 4 : 중화 실험에서 잘 플레이트 설치의 예. 각 항혈청은 중복 (10-1)와 함께 두 개의 열이 할당됩니다. 행은 다른 혈청 희석 (H에 A)을 위해 설계되었습니다. 바이러스 제어 팔 중복 (H11에 A11)와, 열 (11)을합니다. 셀 제어 여덟 중복 (H12에 A12)와 칼럼 (12)이다. 스케일 바 = 10 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5 : 적정 실험의 결과. (a) 웰 플레이트 셋업, (b)는 웰 플레이트 이미지를 검색 (c) 그림컬러 인코딩, 정량, 바이러스에 감염된 세포 집단 및 바이러스 희석액에 대해 (d) 표준화 바이러스 감염된 세포 집단. 30 %는 ICP 임계치로 사용 하였다. (d) 상기 에러 막대 샘플 중복 (± 1 SD)로부터 표준 편차 (SD)이다. (b)와 (c)에서의 스케일 바는 10mm를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6 : 중화 실험의 결과. (a) 웰 플레이트 설정, (b) 웰 플레이트 화상의 정량, 바이러스에 감염된 세포 집단의 (c) 그림과 혈청 희석액에 대한 (d) 표준화 바이러스 감염된 세포 집단 스캔. 입력 VIRUS (VC)은 A / 스톡홀름 / 2,015분의 63입니다. 50 % ICP의 역가를 산출 하였다. (d) 상기 에러 막대 샘플 중복 (± 1 SD)로부터 표준 편차 (SD)이다. (b)와 (c)에서의 스케일 바는 10mm를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 S1 : 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 일반적인 희석 MDCK 세포 MDCK-SIAT1 세포 이일 1 : 5 (1 + 4) 1시 10분 (1 + 9) 3 일 </td> 1시 10분 (1 + 9) 1시 20분 (1 + 19) ml의 당 세포의 전형적인 수 MDCK 세포 MDCK-SIAT1 세포 이일 2 × 10 5 1 × 10 (5) 3 일 1 × 10 (5) 5 × 10 (4) 표 1 : MDCK 또는 MDCK-SIAT1 세포의 합류 플라스크의 하위 문화에 전형적인 희석. 방법 전문가 모드 문서 유형 필름 (필름 지역 가이드와 함께) 자동 노출 유형 사진 임세 유형 24 비트 컬러 해결 1,200 dpi의 저장된 이미지 형식 사소한 말다툼 표 2 : 평판 스캐너의 표준 설치. 열 바이러스 권장 희석 에이 A / 카메론 / 15V-2,016분의 3,538 1.0 × 10 -2 비 A / 블라디보스톡 / 2,015분의 36 1.0 × 10 -3 기음 A / 모스크바 / 2,015분의 103 1.1 × 10 -1 디 A / 톰 스크 / 2천15분의 5 5.9 × 10 -1 이자형 A / 모스크바 / 2,015분의 101 8.3 × 10 -1 에프 A / 모스크바 / 2,015분의 100 1.4 × 10 -2 지 A / 모스크바 / 2,015분의 133 1.3 × 10 -2 H A / 브라 티 슬라바 / 2,015분의 437 1.3 × 10 -4 표 3 : 30 % ICP의 인구에서 계산 된 바이러스 희석. 기둥 항혈청 추천 역가 1-2 A / HK4801 / 2014 (110) 3-4 A / HK7295 / 2014 213.3 <td> 5-6 A / 남아프리카 공화국 / R2665 / 2015 2155.8 7-8 A / 스위스 / 2,013분의 9,715,293 89.4 9-10 A / 네덜란드 / 2,014분의 525 78.6 표 4 : A / 스톡홀름의 50 % ICP / 항혈청에 대한 2천15분의 63에서 역가.

Discussion

본 연구에서는 바이러스 항원 간의 실제 관계를 정량화하는 촬상 계 MN 분석을 설명했다. 다른 플라크 감소 분석과 비교하면,이 방법은 감염 인구의 완전한 커버리지를 보장 전체 웰의 ICP 측정 강조한다. 플라크 형성의 독립성은 주로 보이지 않는 작은 플라크를 형성 할 수 있거나 단지 하나의 세포 감염을 관리 할 수있는 바이러스 분석의 어플리케이션을 넓힌다. 따라서, 분석은 더욱 바이러스 및 HI 항체가보다 넓은 범위의 효과를 조사 할 수 있고, 이는 더 포괄적 유사성 또는 바이러스 항원 ⁽¹²⁾ 사이의 차이를 반영하도록 돕는다. 예를 들어, 오셀 카르 복실 레이트가 포함하면, MN의 분석은 이하 더 정확하게 항원 차이를 반영 결합 NA 의존성에 의해 영향을 받는다. 분석의 개발 과정에서 많은 노력 실험 일관성, 속도 및 검출을 향상시키기 위해 이루어졌다감도 평판 스캐너 높은 처리량 정량화 적정 이미징을 통해 입력 된 바이러스를 제어하는 것을 포함하고, 사용자 친화적 인 데이터 프로세싱 플랫폼을 구현. 결과는 일반적으로 일치 있었고, HI의 사람들을 확인했다. 특히,이 결과는 또한 특정 A (H1N1) pdm09 바이러스 HA1에 G155E 교체 등 배양 선택하거나 산발적 변화에 의한 최근 A 형 및 B 백신 바이러스 항원 드리프트 변종 간의 항원 차이뿐만 아니라, 항원 성 변화를 보여 ^12.

프로토콜은 크게 영상 신호를 강화 강한 감염 준 세포주의 선택과 바이러스 타입 또는 서브 타입을 매칭. 실험적 변이를 시험 항혈청의 개수와 균형 중복 설계 평활화 하였다. 불확실성은 주로 화상 형성 장치에 의해 영향을 받는다 화질로부터 올 수있다. 점잖은 컬러 플랫 베드 스캐너는 유의 수ficantly 이미지 대비를 개선하고 소음을 줄일 수 있습니다. 바이러스가 계속 동일한 상태를 유지하면서 중화에 입력 된 바이러스의 양을 정량적으로 대응하는 적정에서 미리 결정되어야한다. 중화하는 동안 감염에 대한 항혈청 반응의 기준 바이러스 (VC)과 배경 레벨 (CC)의 차이점에 대해 정규화된다. VC 및 CC의 정확한 측정은 중화 실험에 필수적이다. 더 많은 중복 (팔 중복이 대표 결과에 사용 된)을 권장합니다. 마지막으로, 소프트웨어를 이해하는 것이 실험의 성공에 매우 중요합니다. 이 소프트웨어는 2 년 이상에 대한 WHO 인플루엔자 센터, 영국에서 일상적인 바이러스 특성에 대해 테스트되었습니다. 다양한 상황 처리에 대한 자세한 설명은 보충 S1에 제공됩니다.

MN이 분석은 시료가 EXT 커버 용도에 적합remely 큰 시야 만은 적당한 이미지 해상도를 필요로한다. 낮은 비용과 간단한 설치는 대부분의 바이러스학 실험실에 시스템을 쉽게 사용할 수 있도록. 동일한 시료의 측정치의 변화는 대략 ¹¹ 스캔 중에 도입 된 불확실성을 정의 3 % 미만이었다. 이러한 재현성 많은 바이러스 학적 연구에 충분하며, 상기 복수의 스캔 이미지를 평균함으로써 감소 될 수있다.

결론적으로, 본 연구는 통상적으로 항원 성 연구에 사용될 수 있으며, 특히 인간의 인플루엔자 백신에 포함 바이러스 반기 선택할 인플루엔자 바이러스를 현재 순환의 상세한 분석의 HI 데이터를 지원하는 강력한 MN 분석을 보여준다.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

Materials

VGM	Sigma	D6429, P0781	500 ml DMEM+5 ml Pen/Strep^b
PBS A			Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na₂HPO₄ – 1.437 gm, KH₂PO₄ – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L.
Avicell	FMC	RC-581F	2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.
2XDMEM	Gibco	21935-028
Trypsin	Sigma	T1426
Overlay (10ml/plate):			5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml
Triton X- 100^e	Sigma	T8787	Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)
Tween 80	Sigma	P5188	Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v)
Horse serum	PAA Labs Ltd	B15-021	ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80
Mouse MAb against influenza type A	Biorad	MCA 400	1^st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer
Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate	Biorad	172-1011	2^nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer
True Blu peroxidase substrate	KPL	50-78-02	Substrate: True blue +0.03% H₂O₂^g (1:1000 of 30% solution)
96-well flat-bottom microtitre plates	Costar	3596
8 channel multiwall-plate washer and manifold	Sigma	M2656
Perfection Plate Scanner	Epson	V750 Pro	The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads.
Software operational environment: LabVIEW	National Instruments Corporation	Window based with NI Vision builder	Version: LabVIEW2012 or above