定量微中和试验的优化

注：以下协议的生物安全水平（BSL）是季节性流感病毒和BSL 3+为潜在的流感大流行的病毒BSL 2。病毒滴定法需要事先中和实验来决定病毒控制（VC）的病毒浓度。 1.病毒滴度注意：根据病毒的数量和重复的次数，一孔板可以设置具有以下灵活性：（1）病毒稀释可以沿任一的行或列（ 图1）被布置。每个病毒应该占据一个独立的行/列。 （2）病毒稀释增量是柔性的，但它应与在左上角的最高病毒浓度开始。 （3）上有重复的数量没有限制。 注：的Madin Darby狗肾细胞（MDCK）和MDCK-SIAT1（SIAT）细胞好心由M. Matrosovich博士，马尔堡，提供芨芨草许多10。盟细胞是与人的CMP-N-乙酰神经氨酸稳定转染的MDCK细胞：唾液酸（SA）的增强表达β半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶基因α2-6Gal终止寡糖。 等分部分足以MDCK细胞或MDCK-盟细胞8到96孔板（200μl/孔）。孵育细胞在37℃，5％CO 2的2或3天以达到融合。传播补充有10％热灭活胎牛血清（FCS）和抗生素（100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素）的DMEM细胞。孵育盟细胞在37℃，5％的CO 2和1mg / ml G418的硫酸盐。 注：稀释倍数取决于经验和所使用的细胞系。细胞单层必须汇合（即没有细胞壁或MDCK细胞和MDCK-SIAT1细胞紧密堆积布局可见轮廓）在病毒接种时。稀释液的例子基于MDCK或MDCK-SIAT1细胞汇合烧瓶的传代培养于表1中给出。 清洗细胞3次，用200微升每孔病毒生长培养基（VGM）的。消毒用70％乙醇的多层洗板30分钟，然后冲洗在洗涤前的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）或VGM。 吸出VGM，立即加入50微升VGM的每个孔中。 添加900微升VGM到每个6无菌试管中（或更少，这取决于测试的病毒和重复数）。吸取100微升病毒进入第一管，拌匀，并连续稀释，改变每个稀释度之间的提示。重复每个病毒滴定。 注意：这将给予10 -1病毒稀释至10-6。 添加每种病毒稀释液50微升，起始于最高稀释度（1×10 -5 图1），在9重复的孔中（列9和10中的图1）6孔板中。 放置在37℃的板2-3小时以使病毒感染的细胞。 注：A 2至3小时培养是必要的，以确保在接种病毒有足够的时间来达到单层。 准备覆盖（10毫升/板） 注意：覆盖由5毫升的2×DMEM，胰蛋白酶（2微克/毫升的最终浓度），20微升的1毫克/毫升的库存，和5ml纤维素棉短绒（见材料清单）的。 取出接种。 加覆盖（200微升至每孔）。在37℃孵育过夜的，不受干扰。 注：病毒出芽发生之后大约4小时，因此重要的是，该板未在此时间后的干扰。 吸从井中覆盖。 加入冰冷的4％多聚甲醛的PBS（200微升/孔）。将它们放置在4℃下30分钟，或在室温下搅拌20分钟。 注：PBS A是自然pH值的磷酸盐缓冲盐水，10去˚F氯化钠0.25g的氯化钾，1.437克的 Na 2 HPO 4的0.25g的KH 2 PO 4，1升蒸馏水（见材料清单）。 注意：吸入和吞食可能造成灼伤时，多聚甲醛是有害的。还有具有致癌作用的证据有限，和皮肤接触后可能会引起过敏。 吸出多聚甲醛，并用PBS洗涤板两次（200μl/孔）。 存储在PBS A中的板在4℃下以供将来使用，或与下列步骤进行。 添加透化缓冲液（100μl/孔）。离开它在室温下30分钟。 用PBS洗两次板（200微升/孔）。 加入50微升一抗，抗流感A型鼠标单克隆抗体（1：1,000 ELISA缓冲液），每口井。孵育它在室温下1小时（或4℃过夜），在摇动。 在100μl洗涤缓冲液（0.05％吐温80在PBS中A，V / V）的p洗3次呃好。孵育它在室温下洗涤之间5分钟。另外，洗3次，而无需使用每孔300微升孵化。 加入50μl的第二抗体的山羊抗小鼠IgG（H + L）HRP缀合物（1：1000在ELISA缓冲液），每孔。孵育它在室温下搅拌1小时，用摇动。 如在步骤1.17中所述洗3次。 添加底物（50μl/孔）。孵育，在室温下30分钟或直至蓝色的发展是清晰可见。 停止反应，用200μl每孔蒸馏水洗涤平板两次，在室温下温育的洗涤之间2 -3分钟。 空气干燥板，并将其存储在一个黑暗的地方（ 例如，包装在铝箔）。 2.定量滴定放置在平板扫描仪的扫描区一个孔板， 如图2a所示。使用L形的位置限制确保最佳的和可重复的成像位置。 注意：可以将图像两个著名板在一次扫描。 扫描图像。 注：设置示于表2中 。 运行“多孔板阅读器”的软件来计算所需的病毒浓度（ 图3）。 点击“加载图像”按钮，加载图像。滑入“全球阈值”选项卡以调整采样阈值直方图的红条。点击“更新”按钮来检查图像上的效果。 勾选“计算中和/滴定”框。点击“采集”按钮以量化的ICP。点击“保存”按钮，在出现提示时保存采样结果。 注：在采样过程后，如果“计算中和/滴定”框中打勾自动出现一个名为“中和滴定与计算”新窗口。 负载或输入井板定义地图。表明在“滴定：最优病毒种群（％）”的阈值（ 例如，30％）。选择“滴定进程”选项卡来计算滴定结果。检查滴定结果。点击“保存并关闭”按钮，保存滴定结果。 注：请参阅补充S1有关软件的详细说明。可根据要求定制的软件的副本。 注：通常，最好的病毒稀释度为50％左右（20-85％）细胞总数的ICP斑块还原法产量每孔11之内。 3.病毒中和注：计算的中和测定所需板的数量。每个板可容纳一个病毒和一些抗血清。 注意：根据抗血清的数量和重复的次数，一孔板可以设置与第Ë以下灵活性：（1）血清稀释度可以沿任一行或一列（ 图4）被布置。每个血清应该占据一个独立的行或列。 （2）血清稀释度的增量是柔性的，但它应与在板的左上角的最高血清浓度开始。 （3）重复的数量平衡的抗血清的数量。更多的重复可以帮助理顺实验的变化。 （4）在VC的数量和单元控制（CC）的重复是柔性的，但它们也应该是在单独的行或列的数目。据预计，VC副本的数目比抗血清的显著更大。 制备细胞单层，如在步骤1.1-1.3，2或3天提前。 加入50μlVGM的至板的各孔中。 分别用11和12列的VC和CC。添加1:20受体破坏酶（RDE）处理血清的50微升等分试样到科拉姆的第一行（A）的NS 1-10。 注：对于每种病毒和血清结合，该试验一式两份进行，从而一个板可，例如，包含一种病毒对五种抗血清进行测试。 执行从A行从行H.转移50微升到行H（列1-10 图4），并丢弃50微升2倍系列稀释加入50μl稀释液向CC柱（ 图4中第12列）的各孔中。 加入50μl病毒至板的各孔中，除了用于CC柱（列1-11，行AH中图4）。 孵育它在37℃下2-3小时。取出接种。加覆盖（200微升）到每个孔中。过夜孵育它在37℃下，原状。修复和染色板作为病毒滴度（步骤1.11-1.22）。 4.中和定量放置一个孔板在平板扫描仪的扫描区，如图Figu重新2A。使用L形位置的限制，以保证最佳的和可重复的成像位置。 注意：可以将图像两个著名板在一次扫描。 扫描板，如在步骤2.2中描述。 运行“多孔板阅读器”的软件来计算所需的病毒滴度（ 图3，步骤2.3）。 点击“加载图像”按钮，加载图像。滑动“全球阈值”的红色条及时调整采样阈值。点击“更新”按钮来检查的效果。 勾选“计算中和/滴定”框。点击“采集”按钮以量化的ICP。点击“保存”按钮，在出现提示时保存采样结果。 注：在采样过程后，如果“计算中和/滴定”框中打勾自动出现一个名为“中和滴定与计算”新窗口。 负载或输入井-P晚地图。指示阈值（ 例如，50％）“中和：感染扣除（％）”。 选择“中和过程”来计算的滴度。检查滴度，并点击“保存并关闭”按钮，保存中和结果。 注：中和被报告为与预定的ICP还原（如50％或80％）对在VC（11栏的图4中的平均值）的血清的最高稀释度的倒数。 50％的减少ICP是在代表性的成果使用。