Nass- und Trockenlabortechniken Die Kombination der Kristallisation von Large Coiled-Coil-Proteine ​​enthalten, zu Führer

Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie hat zu allen Bereichen der modernen Biologie fundamentale Beiträge geleistet; eine atomare Ansicht der Makromoleküle bieten, die das Leben unterstützen und wie sie miteinander in einer Vielzahl von Kontexten interagieren; ermöglicht es uns, die Mechanismen zu verstehen, die Medikamente entwickeln zu behandeln Krankheit rational Krankheit und Bereitstellung von Möglichkeiten führen zu. Kristallographie ist seit langem die dominierende experimentelle Technik für makromolekulare Struktur zu bestimmen und derzeit einen Anteil von 89,3% der Strukturdatenbank (www.rcsb.org). Diese Technik hat viele Vorteile, einschließlich des Potenzials für eine sehr hohe Auflösung, die Fähigkeit, Makromoleküle zu visualisieren mit einer breiten Palette von Größen, relativ einfache Datenerfassung, und die Möglichkeit, sich vorzustellen, wie das Makromolekül mit Lösungsmittel sowie Liganden in Wechselwirkung tritt.

Trotz zahlreicher technologischer Verbesserungen in der rekombinanten Proteinexpression ^1,2, purifizierung ³ und Molekularbiologie diese Systeme ^4, das größte Hindernis in der kristallographischen Verfahren zur Erzeugung verwendet wird, bleibt die Fähigkeit Beugungs Kristalle zu züchten. Dies war vor allem für Proteine, die große Coiled-Coil-Domänen enthalten. Es wurde geschätzt , dass bis zu 5% aller Aminosäuren innerhalb Coiled-Coils ^5,6, so dass dies eine sehr häufige Strukturmerkmal ⁷ gefunden werden, doch sind diese Proteine sind oft schwierig zu reinigen und zu kristallisieren als globuläre Proteine ^8-10 . Dies wird weiter durch die Tatsache verstärkt, dass Coiled-Coil-Domänen oft im Rahmen eines größeren Proteins gefunden werden, deshalb richtig, die Grenzen dieser Domänen Vorhersage ist kritisch, um die Aufnahme von unstrukturierten oder flexible Sequenz zu vermeiden, die für die Kristallisation oft nachteilig ist.

Hier präsentieren wir einen konzeptionellen Rahmen kombiniert webbasierte Berechnungsanalysen mit Experimental Daten aus der Bank, führen den Benutzer durch den Anfangsstadien der kristallographischen Prozess zu helfen, einschließlich: wie Proteinfragment auszuwählen (e) für Strukturuntersuchungen, und wie die Vorbereitung und Proteinproben vor der Kristallisation Versuche charakterisieren. Wir konzentrieren unsere Analyse auf zwei Proteine ​​große Coiled-Coil-Domänen enthält, Shroom (SHRM) und Rho-Kinase (Rock). Diese Proteine wurden ausgewählt , da sie beide Coiled-Coil – Domänen enthalten und sind dafür bekannt , eine biologisch relevanten Komplex ^11-16 zu bilden. Shroom und Rho-Kinase (Rock) vorhergesagt werden ~ 200 und 680 Reste von Coiled-Coil enthalten jeweils viele Teile davon wurden strukturell ^17-20 gekennzeichnet. Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Workflow schnell Fragmente von Coiled-Coil-haltiges Protein zu identifizieren, die für die Kristallisation geeignet sein wird, aber die beschriebenen Techniken können leicht für die meisten Protein oder Protein-Komplexe oder modifiziert angepasst werden Hochdurchsatz approa einzuarbeitenChes als verfügbar. Schließlich sind diese Verfahren im allgemeinen nicht teuer und können durch Nutzer an nahezu allen Erfahrungsstufen durchgeführt werden.