Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Hücre içi bölümlerinde geçici büyümek veya ikamet patojenler terapötik tedavisi zordur. Zorlayıcı yada nispeten gibi Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp gibi hücre içi patojenler zorunlu. Francisella tularensis ve Mycobacterium spp. genellikle aylar hatta yıllar arasında değişebilir tedavisi için antibiyotik tedavisi ders uzamış gerektirir. Ayrıca, hücre dışı patojenler geçici hücre içi nişler işgal ve bu şekilde antimikrobiyal tedavinin normal kurslar açıklığı kaçmak ve daha sonra öldürücü enfeksiyon yeni mermi başlatmak için ortaya çıkabilir. Staphylococcus aureus ¹ ve üropatojenik Enterobacteriaceae ^2,3 enfeksiyonları iki giderek tanınan örneklerdir. Bu nedenle, temel bir ilaç keşif hedefi hücre içi bölmelere nüfuz yeni antimikrobiyal tespit etmektir. Optimal tedavi hızla ortadan kaldırmak içinhücre içi organizmalar ve alt önleyici antimikrobiyal maruz kalma yoluyla direnç gelişmesini önlemek, özellikle tercih edilir.

Bu amaçla, biz modeli patojen Legionella pneumophila hücre içi büyüme hedefleyen hücre içi sızan antimikrobiyallerin tanımlamak için bir yüksek verimli bir tarama teknolojisini geliştirdi. ⁴ Önceki klinik gözlemler, standart antimikrobiyal duyarlılık testi doğru bu organizmaya karşı in vivo terapötik etkinlik tahmin etmediğini göstermektedir. Bu β-laktamlar ve aminoglikozid olarak antimikrobik temel sınıfları, aksenik biçimde yetiştirilen Legionella karşı son derece etkili olmasına rağmen, yeterli Legionella bulunan hücre içi nüfuz çünkü ⁵ Özellikle, bu oldu. ^5,6 Daha sonra delil teknik olarak daha karmaşık hücre içi büyüme analizleri etkili bir klinik etkinliğini tahmin önerdi. ⁷ </sup> Ne yazık ki, bu deneyler koloni oluşturan birim sayımı için farklı zamanlarda noktalarında parçalanması gereken antimikrobik tedavi edilen enfekte makrofajlar, gerektiren son derece zahmetli uç noktaları deneyleri idi. Bu gibi deneyler, büyük ölçekte yapılacak pratik değildir ve yüksek verimli ilaç keşfi için uygun değildir.

Bu nedenle, hücre içi bakteri büyümesine, gerçek zamanlı saptanması için teknoloji geliştirilmiştir. ⁶ Bu bakteriyel kromozoma ⁴ ya da floresan proteini (daha önce tarif edilen, birinci kuşak deneyi) ya da bakteriyel lusiferaz operon ⁸ entegrasyonu ile modifiye edilmiş bir bakteri suşu kullanılarak ⁹ muhabir (burada tarif edilen ikinci kuşak, dik deney) gerçekleştirilmiştir. Bu şekilde, ışık veren veya flöresanlı bir sinyal bakteriyel sayısının bir taşıyıcı, gerçek zamanlı olarak okunmasını sağlar.

Ancak, bu nitelikler hücre içi infectio büyük bir karıştırıcı adresi yokn deneyleri, konakçı hücreler üzerinde hedef dışı etkiler. Özellikle, konakçı hücre ölümü doğal hücre büyümesini sınırlar ve antimikrobiyal etki yanlış pozitif bulmaktır. Tarama kütüphanelerinde olduğu gibi birçok bileşik ökaryotik hücre toksik, böyle yanlış pozitif takipte, çözüm için son nokta sitotoksisite deneyleri çok sayıda gerektiren, gerçek antimikrobiyal korkutur olacağını vardır.

Bu durumda, aynı anda ökaryotik hücre canlılığı ve hücre içi büyümeyi değerlendirmek mümkün büyük ilgi olmuştur. Özellikle, canlı olmayan ökaryotik hücrelerin karakteristik hücre zarı bütünlüğünün kaybıdır. hücre membranının geçirgenliği test probları, bu nedenle, hücre canlılığını değerlendirmek için de kullanılabilir. Daha önce ulaşmak ve ölü hücrelerin nükleer DNA leke putatif hücre zan-geçirgen olmayan, floresan, DNA bağlayıcı boyaların bir dizi becerisi ile karakterize edilir. ⁴ nükleer DNA bağlayıcı, bu boyalar, kuantum bir büyük artışı gösterecektirArka plan çözüm floresan üzerinde artan sinyal sonuçlanan m floresan verim. Bu nedenle, bu boyalar, ökaryotik hücre ölümünün kantitatif okuma sağladı. ⁴ Özellikle, biz birkaç J774 makrofajlar ile uzun süreli işbirliği inkübasyon sırasında kendileri toksik olmayan olduğu bulundu. ilk enfeksiyon sırasında ilave zaman, gerçek zamanlı, mikroskopik bir mikro florimetre ile ölçülür ve gözlemlenebilir ökaryotik hücre ölümünün flüoresan okuması sağlamaktadır.

Bu nedenle, bir bakteri muhabir ve toksik olmayan, zar geçirgenliği olmayan kullanımını birleştirerek, DNA bağlayıcı boyalar, biz bakteri yükü ve aynı zamanda ökaryotik hücre sitotoksisitesini hem ölçmek için basit, tahribatsız, gerçek zamanlı test geliştirmek başardık. Bu deney, US hücre içi büyümesini inhibe etme yeteneği için ~ de dahil olmak üzere fonksiyonel olarak karakterize edilmemiş aktivitesi 250 antimikrobiyal ve> 240,000 küçük molekülleri 384 oyuklu plaka biçiminde ekran ~ 10,000 bilinen biyoaktif maddelerin sağladıLegionella pneumophila, aynı zamanda her bir bileşik için ökaryotik hücre sitotoksisite verileri oluştururken. Legionella hücre içi büyümeye karşı bilinen antimikrobiyal ⁶ Yaptığımız analizler bugüne kadar bu tip en kapsamlı araştırma oldu. ⁶

bir arada kullanıldığında, bizim deney formatının verimliliği göre, aynı zamanda, daha sonra bilinen antimikrobiyal potansiyel sinerjistik etkiler araştırdı. En yaygın sinerji testlerinin bir sözde dama deneyi, standart olarak iki ya da daha çok antimikrobik maddenin iki kat seri dilüsyonları kombinasyon etkilerinin değerlendirilmesi ile gerçekleştirilir. İki ya da daha çok antimikrobik madde, ayrı olarak uygulanan her etkilerin toplamından daha birlikte uygulandığında, bu deneylerde ^10, sinerji daha etkisinin gözlenmesi ile tanımlanır. Unutmayın ki, şimdiye kadar, sadece odaklanmış ve seçici sinerji testi, hücre içi Legionella pneumophila karşı yapıldı </em> gerekli birleştirici permütasyon ile çarpılır geleneksel uç nokta deneylerinde yer alan büyük bir çaba çünkü.

Sinerji testi kolaylaştırmak için, otomatik dijital dağıtım teknolojisi ⁶ ile birlikte bizim gerçek zamanlı hücre içi büyüme / ökaryot sitotoksisite deneyi kullandı. Bu otomasyon DMSO veya sulu bir çözelti tek başına ya da 384-kuyucuklu bir biçimde kombine içinde çözülmüş bileşiklerinin seri seyreltmeleri dağıtmak için izin. ¹¹ Ayrıca, bu tür sağlam sıvı taşıma teknolojisi kolayca daha yüksek çözünürlük gerçekleştirmek için bize izin, kare-kök-iki (yerine standart daha düşük çözünürlük, katlama), iki boyutlu olarak özgüllüğünün yüksek düzeylerine ulaşmak için seyreltme kombinasyonları, dama tahtası sinerji analiz. İki katlı bir seyreltme serisi ¹² kullanırken bu çözünürlük tekrarlanabilirlik ilgili sinerji alanında endişeleri ele özellikle değerliydi. Son olarak, bizim tahlil nicel ve ayrıca therefore inhibisyon geçişleri ölçüldü. Bunun bir sonucu olarak, deney büyüme inhibisyonu benzer olan kombinasyon konsantrasyonları bağlantı isocontours olan isocontour isobolograms içinde eksprese önleyici tüm bilgileri, yakalanan. ⁶ Bu çizim stratejisi kombinatoryal doz-yanıt eğrilerinin görselleştirme sağladı. Bizim metodoloji göstermek için, bu analizleri gerçekleştirmek için bizim protokol tarif ve temsili sonuçlar göstermektedir.