在清除胚胎心脏冠状血管分析

所有的动物研究是按照机构准则许可由英国内政部进行。 1.解剖和胚胎红心固定安乐死上使用伦理批准剔除技术， 例如，CO 2麻醉颈椎脱位所需天定时怀孕小鼠，并取出胚胎囊14，将它们放置在一个10cm培养皿充满磷酸盐缓冲盐水（PBS） 。 使用解剖显微镜和镊子，小心翼翼地打开了子宫囊，取出每个胚胎，切断脐带和去除卵黄囊。 对于基因分型的目的，去除胚胎尾部，地点在裂解/ DNA提取后，一个1.5 ml离心管。 为了去除心脏，引脚每个胚胎出其在的PBS填充的硅氧烷弹性体涂覆35毫米培养皿背面，采用不锈钢minutien销。用细镊子，CArefully打开胸腔并切断大血管，前心脏。然后到达身后镊子的心脏，抓住后面的心脏血管和拉轻轻取出心脏;肺部也可能在同一时间一起离开。 的心脏转移到含有PBS中新鲜35毫米培养皿，并使用细镊子如果需要修剪掉肺组织。然后将心脏转移到填充有冷PBS一个48孔板的孔中。 收集所有的心在48孔板后，吸出PBS用细尖的塑料巴斯德吸管，并用0.5毫升4％多聚甲醛（PFA）取代。 小心：PFA是一种已知的过敏，致癌和有毒的。 修复E11.5 – 12.5心15分钟，E13.5心20分钟，并E14.5 – 15.5心30分钟，在4％PFA室温。 吸出PFA用细尖的塑料巴斯德吸管和冲洗的心2个冷PBS。 CAUTION：PFA是危险的，并按照规定的制度，必须进行处理。 如果不是整个装载免疫立即使用（见第2部分），通过在以下的溶液进行连续5分钟洗涤脱水心中：25％甲醇/ 75％PBS中，50％甲醇/ 50％PBS中，75％甲醇/ 25 PBS％。 注意：甲醇是有毒的，戴手套。在100％甲醇-20℃储存的心。 2.胚胎心脏的全山免疫染色与反PECAM1抗体注：抗PECAM1抗体工作良好染色的冠状血管（参见步骤2.4），但任何泛内皮标记物，给出了一个可靠的信号是合适的。 如果使用已储存在100％甲醇中心，转移到1.5 ml微量离心管，并通过在下述溶液进行连续5分钟洗涤再水化：75％甲醇/ 25％PBS中，50％甲醇/ 50％PBS中的25％甲醇/ 75％PBS中。 </li> 1.0毫升PBST（PBS / 0.1％吐温20），在室温下旋转 – 通过在0.5执行3×10分钟洗涤通透的心。 通过在室温下在在PBST1.0毫升10％山羊血清1小时旋转框的心。 用细尖的塑料巴斯德吸管或1000微升枪头，删除封闭液并用400取代 – 含1:50稀释的抗PECAM1一抗500微升新鲜块。于4℃过夜旋转管。 第二天，吸块/一抗用细尖的塑料巴斯德吸管或1000微升枪头，并于1.0ml PBST进行至少6倍的1小时清洗，在室温下旋转管。 替换用含有稀释1所述荧光团共轭的二级抗体新鲜封闭缓冲液在最后一次洗涤：500，并在4℃下孵育过夜，用旋转。通过在铝箔包装管避光。 第二天，吸块/秒用细尖的塑料巴斯德吸管ondary抗体，并进行至少6倍1小时洗于1.0ml PBST，在室温下旋转管。 在4℃（避光），直到需要存储的心。 3.结算解决方案和显微镜菜的制备注意：当在BABB成像心中至关重要的是，没有一个BABB溶液进入与显微镜的部件的接触。为此目的，以下方案包含用于制备适于荧光显微镜硅氧烷弹性体密封的菜肴，可提前做好准备的指示。有机硅弹性体提供一种屏障以包含BABB并防止它从玻璃底部和盘的聚碳酸酯侧面之间潜在的渗漏。 为了准备有机硅弹性体涂层的菜肴，以光学玻璃底培养皿，并将从4毫升螺丝帽小瓶顶部（约1.5公分）在每个培养皿的中心。 注：当弹性体被施加到盘这将形成一个良好的样品。 填充的硅氧烷弹性体的菜至大约0.5cm的深度，用涂布器盒，它们被施加到两个组分混合，根据制造商的说明。离开以固化至少24小时，确保瓶盖保持在每个培养皿的中心。 注：使用安全眼镜，以避免眼睛有机硅弹性体的偶然接触。 固化该弹性体后，从各皿的瓶盖，这会留下一个中央孔，其中待成像的样品可以被放置在与餐具的玻璃底直接接触。 注：固化后的弹性体应牢固，干燥的触感。 制备BABB溶液（1份苄醇2份苯甲酸苄酯）。这应储存在玻璃瓶中并避光。 注意：BABB是有毒的，腐蚀性的溶液。处理在通风橱，而穿相应的防护服。 混合BABB和甲醇，制成50:50溶液 – 在玻璃小瓶（1 5ml）中。从光， 如保护，通过包装箔小瓶。 4.脱水，结算和共聚焦显微镜红心安装注：较大的样品可在4毫升玻璃瓶中被清除，但是对于小样本（ 如，心达E13.5）最好是在显微镜菜直接进行结算的过程。这有助于防止“丢失”的样品一样的心变得很透明，一旦清理。对于这些小样本结算是非常迅速的，在几分钟之内发生。 注：避光样品中通过包装/覆盖管和菜带箔以下所有步骤。 清理前，在室温旋转坦佩心中脱水通过甲醇系列中的免疫染色，心叉涂抹在下列溶液的连续变化的1.5 ml离心管：25％甲醇/ 75％PBS中，50％甲醇/ 50％PBS中和75％甲醇/ 25％PBS中（5分钟在每个）。最后，转动，以便在100％甲醇中3×5分钟。 对于心达E13.5，发生在显微镜盘的中心;在显微镜下保证心脏被定向，其背侧浮上心头。来自各地的心脏用细尖的塑料巴斯德吸管取出任何甲醇。 （ – 400微升约300个）的足量沉浸在心脏甲醇50:50的解决办法：用干净的细尖塑料巴斯德吸管，添加BABB。由于心中有时可以在溶液空翻多，再次检查方向，而心中仍然不透明。留在5分钟的溶液中。 在通风橱中取出50:50解决了玻璃废液瓶和BABB更换，再次使用一个带尖的塑料巴斯德吸管。 注：不需要大容量;添加SUFFicient使心脏位于溶液滴内。该心脏应在5分钟内清除。 对于较大的心灵，清除玻璃小瓶样品。 注释：E15.5心脏应该清楚在30分钟，1小时，但如果需要的话可以留过夜。 样品是清楚后，取出溶液并用BABB的最小体积替换。任选，盖上盖玻片样品，以帮助保持在适当位置，然而，这不是绝对必要的。使用心脏成像。 5.成像清除心激光共聚焦显微镜注：图像，使用10X或20X干燥目标倒置共聚焦显微镜拍摄的。尽管有可能使用在一个直立共焦的菜，额外必须小心，以避免与BABB溶液物镜接触。 收集心脏15的Z扫描。根据心脏的大小，瓦片扫描可能需要图像整个心脏16。 <br/> 注意：BABB是一种腐蚀性溶液，戴上干净的手套，并确保显微镜盘的外面是从BABB免费。小心处理的菜，并保持在盘盖，以减少意外泄漏的到显微镜的风险。 如果目标工作距离允许，使用较高的放大倍率获得的感兴趣区域的更高分辨率的图像。 6.数据分析应用软件斐济打开图像的Z堆栈在斐济17。 为了使整个堆栈或它的一部分的AZ投影，点击图片并选择堆栈，然后由Z项目。进入启动和停止切片编号和特定的z的投影， 例如，平均强度，最大强度的类型。 为了形象片使用吹塑工具的堆栈中彰显个性的船只（从插件菜单中选择分割，然后吹/套索工具），然后单击图像的区域在EA填写CH片。使用填充命令（点击编辑，然后选择填充）与选择的前景色填充所选的区域（点击编辑，然后选择选项，其次是颜色和前景）。 ž项目的形象和以前一样叠加。 冠状动脉7.三维曲面体绘制生成使用了Imaris 点击超越视图图标在屏幕的顶部和拖动和图像文件拖放到数据窗口。点击三维视图图标在屏幕的顶部。 选择面图标（蓝色图标），然后单击创建选项卡上。点击“跳过自动创建，手动编辑”对话框，单击绘图图标（瘦铅笔图标）。 选择轮廓选项卡，然后在模式选项卡。在模式中，点击魔棒或等值线图的图标。点击旁边的“选择”选择在屏幕的右侧指针选择指针模式，然后点击“绘制9;框（在屏幕的左下角）。 使用等值线或魔棒工具连续切片选择动脉的轮廓。从切片导航使用切片位置滑块片。 当所有的轮廓都被选中，单击创建面框。周边体积可以做得不可见，或者使用混合模式呈现或多或少不透明;点击音量选中它，然后选择设置选项卡，其次是模式选项卡。选择Blend和使用滑块以更改透明度。 捕获使用快照功能的图像。