Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios

MS es una enfermedad humana caracterizada por la inflamación crónica y la neurodegeneración del CNS que se piensa para ser accionado por una respuesta autoinmune dirigida hacia la mielina. La pérdida de mielina y axones a través del tiempo como resultado la disminución gradual de la función cognitiva y motora ^1. "Encefalomielitis autoinmune experimental" es un término general para los modelos animales de enfermedad autoinmune dirigida hacia la mielina del SNC. Como MS humanos, EAE se caracteriza típicamente por la infiltración de células inmunes del sistema nervioso central y, en algunos casos, la desmielinización ^2. Sin embargo, el grado en que cualquier modelo de EAE dado asemeja MS humana, en parte, depende de la especie o cepa utilizada y de la complejidad de la respuesta autoinmune anti-mielina subyacente.

autoinmunidad anti-mielina puede ser inducida experimentalmente en varias formas, pero el método más común usado hoy en día es para inmunizar ratones con un péptido corto de aminoácidos que imitan la CD4 inmunodominante <sarriba> + epítopo de células T de una proteína de la mielina. Esto representa el requisito mínimo de inducir una respuesta patógena. Tal vez el más común de ellos es un péptido de 21 aminoácidos derivado de la glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG _35-55), que se utiliza para inducir la EAE en ratones C57BL / 6 ^3. Sin embargo, para algunos fines experimentales es deseable o incluso necesario para inmunizar con los antígenos proteicos más grandes y de hecho hay varias ventajas a esto más de la inmunización con el péptido corto. En primer lugar, debido a la restricción MHC, los péptidos cortos son por lo general sólo es eficaz en un rango muy limitado de cepas, mientras que los antígenos de proteínas más grandes que representan ya sea toda la proteína o un dominio específico se pueden procesar normalmente para su presentación en múltiples cepas de ratón endogámica o incluso en diferentes especies ^4. En segundo lugar, un antígeno de proteína más grande es capaz de inducir una respuesta inmune más compleja la incorporación de más tipos de linfocitos en el reconocimiento de antígenos, en lugar de limiting reconocimiento del antígeno a las células T CD4 ^+. Por ejemplo, las células B a través de su receptor de células B (BCR) interactúan directamente con todo en lugar de procesado de proteínas. Nosotros y otros han demostrado que las células B activadas por MOG _35-55 inmunización no reconocen la proteína MOG ^5. Puesto que las células B se ha demostrado recientemente para jugar un papel patogénico en MS humano ^6, los modelos de EAE que incorporan células B en la patología autoinmune son cada vez más importante.

A pesar de las ventajas del uso de antígenos de proteínas de mayor tamaño para inducir EAE, quedan pocas fuentes disponibles en el mercado para tales proteínas. En efecto, mientras que los péptidos cortos como MOG _35-55 pueden sintetizarse muy rápidamente y a un coste relativamente bajo, las opciones comerciales para la proteína MOG es limitado y el coste sustancialmente más para comprar. No obstante, hay varios vectores de expresión disponibles para los grupos de investigación para generar MOG dominio extracelular (MOG _1-125) propios. however, todos los sistemas de expresión que hemos identificado en la literatura se basan en las tecnologías más antiguas que ya han sido reemplazados con sistemas de expresión más eficientes ^7. Además, la mayoría se basan en rata o humano MOG ^8. Para algunas investigaciones de la autoinmunidad en los ratones, un antígeno basado en el autoantígeno MOG ratón es preferible. Por último, todas las proteínas a base de MOG que hemos identificado, ya sea comercial o como vectores de expresión, son proteínas de fusión que contienen aminoácidos adicionales a la base MOG _1-125. Estos incluyen una etiqueta para la purificación y por lo general otras secuencias, así, muchas de las cuales con una función que no pudimos identificar.

Para hacer frente a estas limitaciones, hemos generado una nueva proteína de fusión basada en el ratón MOG dominio extracelular fusionado a una etiqueta que contiene tiorredoxina para combatir la insolubilidad de la proteína conocida MOG ^5. La secuencia de etiqueta también contiene una secuencia 6xHis para la purificación y un CLE proteasa TEVsitio Avage que permite la eliminación completa de todas las secuencias de etiqueta, si se desea. Este es el único método que somos conscientes de generar pura proteína MOG _1-125. Para facilitar la producción de grandes cantidades de proteína, la secuencia de MOG _1-125 fue optimizado codón para la expresión bacteriana y se insertó la proteína de fusión _tag MOG en el sistema de expresión pET-32. A continuación, describimos en detalle el protocolo para producir y purificar la proteína _{etiqueta de} MOG, y MOG _1-125 pura, utilizando equipos no especializados disponibles para la mayoría de los laboratorios de inmunología.