Простое и эффективное производство и очистка мыши миелина олигодендроцитов гликопротеина для экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита исследований

МС представляет собой человека заболевание, характеризующееся хроническим воспалением и нейродегенеративные ЦНС, которые, как полагают, будут обусловлены аутоиммунного ответа, направленного в сторону миелина. Потеря миелина и аксонов с течением времени приводит к постепенному снижению когнитивной и двигательной функции ^1. "Экспериментальная аутоиммунный энцефаломиелит" является общим термином для животных моделях аутоиммунных заболеваний, направленной на ЦНС миелина. Как человека MS, EAE , как правило , характеризуется иммунной клеточной инфильтрацией ЦНС и, в некоторых случаях, демиелинизация ^2. Тем не менее, степень, в которой любая данная модель ЕАЕ напоминает человеческую MS частично зависит от вида или штамма, используемых и по сложности нижележащей анти-миелинового аутоиммунного ответа.

Анти-миелина аутоиммунные может быть экспериментально индуцированных несколькими способами, но наиболее распространенный метод, используемый сегодня для иммунизации мышей с коротким пептидом аминокислот, имитирующих иммунодоминантный CD4 <sвверх> + Т – клеточный эпитоп белка миелина. Это представляет собой минимальное требование, чтобы вызвать патологическую реакцию. Пожалуй, наиболее распространенным из них является пептидным 21 амино- полученный из миелин олигодендроцитов гликопротеин (MOG _35-55), который используется для индукции EAE в C57BL / 6 мышей ^3. Тем не менее, для некоторых экспериментальных целей желательно или даже необходимо вакцинировать с более крупными белковых антигенов и в самом деле есть несколько преимуществ этого более короткого иммунизации пептида. Во-первых, из-за ограничения MHC, короткие пептиды, как правило, эффективны лишь в очень ограниченном диапазоне напряжений, в то время как более крупные белковые антигены, представляющие либо весь белок или конкретный домен может быть обработан как правило, для представления в нескольких штаммов инбредных мышей или даже у разных видов ^4. Во-вторых, больший белковый антиген, способный индуцировать более сложный иммунный ответ, включающий более типов лимфоцитов в распознавании антигена, а не limitinг распознавание антигена к CD4 ⁺ Т – клеток. Например, В-клетки через их B клеточного рецептора (BCR) взаимодействуют непосредственно с целым, а не обработанного белка. Мы и другие показали , что В – клетки активируются MOG _35-55 иммунизации не признают MOG белок ^5. Так как В – клетки были недавно продемонстрированы играть патогенную роль в человеческом МС ^6, модели EAE , которые включают В – клеток в аутоиммунной патологии приобретают все большее значение.

Несмотря на преимущества использования более крупных белковых антигенов для индукции EAE, остаются несколько коммерчески доступных источников для таких белков. В самом деле, в то время как короткие пептиды , такие как MOG _35-55 , могут быть синтезированы очень быстро и при относительно низкой стоимости, коммерческие варианты белка MOG ограничены , и стоимость значительно больше , чтобы купить. Тем не менее, существует несколько векторов экспрессии , доступных для исследовательских групп для создания MOG внеклеточный домен (MOG _1-125) сами. Howeveг, все системы экспрессии , которые мы определили в литературе, основаны на старых технологиях , которые с тех пор были заменены на более эффективные системы экспрессии ^7. Кроме того, большинство из них основаны на крысиной или человеческой MOG ^8. Для некоторых исследований аутоиммунные у мышей, антиген на основании мыши MOG аутоантигенов является предпочтительным. И, наконец, все MOG на основе белков , которые мы определили, либо коммерческие или как векторы экспрессии, представляют собой слитые белки , содержащие дополнительные аминокислоты к основанию MOG _1-125. Они включают в себя тег для очистки и, как правило, другие последовательности, а также, многие из которых с функцией мы не смогли определить.

Для устранения этих ограничений, мы получили новый слитый белок на основе мыши MOG внеклеточного домена , слитого с меткой , содержащей тиоредоксин для борьбы с известной нерастворимость MOG белка ^5. Последовательность тэгов также содержит последовательность 6xHis для очистки и протеазы TEV НКУсайт Avage, что позволяет полного удаления всех последовательностей тегов, если это необходимо. Это единственный метод , который мы отдаем себе отчет , чтобы генерировать чистый MOG _1-125 белка. Для облегчения производства больших количеств белка, последовательность МОГ _1-125 была оптимизированными в отношении кодонов для экспрессии в бактериях и _тег слитый белок МОГ был вставлен в систему экспрессии , пет-32. Здесь мы опишем подробно протокол для получения и очистки MOG _тегов белка, и чистый MOG _1-125, используя неспециализированной оборудование , доступное для большинства иммунологических лабораторий.