Análisis de la importación de proteínas en cloroplastos aislados de las plantas estresadas

1. Crecimiento de las plantas de Arabidopsis y el Tratamiento del estrés Preparar 1 L de Murashige y Skoog (MS) mediante la adición de 4,3 g de MS Basal Sal mezcla, 10 g de sacarosa, 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) a agua desionizada hasta 1 L, y ajustar el pH a 5,7 con hidróxido de potasio (KOH). Añadir 6 g de fitoagar y autoclave durante 20 minutos a 120 ° C. Antes de la solidificación, se vierte el medio en placas de Petri redondas (diámetro 9 cm, altura 1,5 cm, con 20 a 25 ml de medio MS por placa). Dejar que las placas se sequen durante ~ 1 h en una campana de flujo laminar antes de cerrar los párpados. Coloque semillas de Arabidopsis thaliana en un tubo de ensayo 1,5 ml para la esterilización de la superficie mediante la adición de 1 ml de etanol al 70% (v / v) que contiene 0,02% (v / v) de Triton X-100 y continua agitación durante 5 a 10 min. Para cada genotipo / condición, se preparan 10 placas de Petri cada uno con ~ 100 – 150 plantas de semillero. Espere unos 10 s hasta que las semillas se depositan en elparte inferior del tubo, y luego se descarta el sobrenadante mediante pipeteo. Añadir 1 ml de etanol al 100%, y agitar el tubo de nuevo durante 10 minutos. Preparar la campana de flujo laminar, mientras que las semillas están esterilizando. Tome una hoja de papel de filtro por muestra, doblar por la mitad para facilitar la siembra, y sumergirlo en etanol al 100% en la campana. Espere hasta que se seque por completo. Tenga en cuenta que el etanol 100% se utiliza ya que se evapora más rápidamente que 70% de etanol. La transferencia de las semillas sobre el papel de filtro con la pipeta 1 ml usando una punta de pipeta de corte ~ 5 mm del extremo fino. Deje que se seque, que debería tener alrededor de 10 – 15 min. Sembrar ~ 100 – 150 semillas esterilizadas de manera uniforme sobre cada placa Petri medio MS, y sellar cada placa con cinta quirúrgica. Almacenar las placas boca abajo a 4 ° C por 2 – 4 d fomentar y sincronizar la germinación. semillas de edad pueden necesitar permanecer más tiempo (hasta una semana) a 4 ° C. La transferencia de las placas a una cámara de cultivo de tejidos vegetales y dejarlos boca arriba.Cultivar las plantas de 8 d bajo un ciclo de día largo (16 h 100 mol · m – 2 · s – 1 luz, 8 h de oscuridad) a 20 ° C. Para el tratamiento de estrés, cuando las plantas son 8 d de edad, en la campana de flujo, transferirlos desde el medio de agar, raspando suavemente con la mano con guantes de etanol-esterilizado, en un matraz esterilizado de medio MS líquido que contiene el factor de estrés (por ejemplo, , 200 mM de manitol). Evitar realizar sobre un medio de agar. Cubrir la boca matraz con papel esterilizado y permitir que las plantas para crecer en las mismas condiciones que en el paso 1.8 para una 2 d adicionales en un agitador orbital con agitación suave (~ 100 rpm). 2. Realización de una proteína precursora de Transcripción in vitro / Traducción Nota: Este protocolo supone el uso de Arabidopsis fotosistema I subunidad precursor D (pPsaD) como la plantilla / preproteína, pero el método es compatible con los demás. <ol> Clonar la secuencia codificante (CDS) de pPsaD en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pBluescript II SK (o cualquier otro vector similar con un promotor T7 aguas arriba) 13. Se purifica el plásmido (pBSK-pPsaD) utilizando un kit de aislamiento de ADN y verificar la secuencia mediante secuenciación de ADN. NOTA: Todos estos pasos emplean técnicas de clonación molecular convencionales. Determinar la concentración de ADN de plásmido pBSK-pPsaD usando un espectrofotómetro ajustado a medir la absorbancia a 260 nm. Diluir el plásmido a una concentración final de 10 ng / mL. Ejecutar un l PCR 20 (para 35 ciclos) usando el plásmido diluido como molde. Preparar la reacción de la siguiente manera: 2 l 10 x tampón de polimerasa, 2 l dNTPs 2 mM, 1 l 5 mM M13 cebador directo (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 l cebador inverso M13 5 mM (5 '-CAG GAA ACA TCG ATG ACC-3'), 1 l diluido pBSK- pPsaD plásmido, 1 U de Taq polimerasa, y agua destilada para obtener el volumen total de reacción hasta20 l. Utilice un programa de PCR estándar, como sigue: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de [95 ° C, 30 seg; 56 ° C, 30 seg; 72 ° C, 30 seg); y 72 ° C, 5 min. Ejecutar 5 l de producto de PCR en un 1% (w / v) en gel de agarosa en tampón TAE (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM de ácido acético, EDTA 1 mM) para verificar la amplificación correcta del cDNA, y cuantificar la pertinente banda respecto a los estándares para confirmar la concentración. Guardar el resto del producto a -20 ° C para otras aplicaciones. Preparar una reacción de 50 l usando un sistema de reticulocitos de conejo lisado basado libre de células de transcripción / traducción compatible con el ADN de PCR, como sigue: 40 l de lisado de reticulocitos del sistema de transcripción / traducción, 2,5 l radiomarcado [35 S] metionina, 11 Ci / mL (actividad específica:> 1000 Ci / mmol), agua destilada de 2,5 l estéril, y 5 l producto pPsaD PCR (100 – 800 ng). Precaución: Use guantes, ropa de laboratorio y vidrio de seguridadses al manejar material radiactivo. Monitorear y descontaminar la superficie de trabajo y equipo. Disponer de todos los residuos radiactivos en un contenedor de residuos autorizado. Incubar la reacción durante 90 min en un baño de agua C 30 °. Detener la reacción mediante la colocación de la muestra en hielo. Eliminar 1 l de la reacción en forma de una muestra de ensayo (el mismo volumen también puede servir como un control de entrada para el paso 5.7) para la verificación en la electroforesis estándar dodecil de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), seguido de autorradiografía, fluorografía o formación de imágenes de fósforo. Un buen resultado se indica mediante la observación de una banda distinta y fuerte que corresponde al peso molecular de pPsaD (~ 23 kD). Almacenar el resto de la reacción a -80 ° C para otras aplicaciones. 3. Aislamiento de cloroplastos Preparar las siguientes soluciones madre: Preparar el aislamiento de cloroplastos Buffer (CIB, 2x): 0,6 M de sorbitol, cloruro de magnesio 10 mM(MgCl 2), etileno glicol 10 mM tetraacético (EGTA), 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), bicarbonato de sodio 20 mM (NaHCO 3), 40 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) ; ajustar el pH a 8,0 con KOH. Preparar 2 l de 2x CIB, hacer alícuotas y conservarse a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo, oa 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo. Para hacer 1x CIB, se diluye la CIB 2x 1: 1 con agua destilada; esto puede ser preparado recientemente en el día del experimento aislamiento cloroplasto. Preparar HEPES-MgSO4 tampón Sorbitol (HMS, 1x): HEPES 50 mM, 3 mM de sulfato de magnesio (MgSO4), 0,3 M de sorbitol; ajustar el pH a 8,0 con hidróxido de sodio (NaOH). Preparar 400 ml de tampón, hacer alícuotas y conservarse a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo, oa 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo. Llevar a cabo todos los procedimientos siguientes en el cuarto frío o en hielo. Pre-enfriar todas las soluciones, dispositivos, equipos, y los rotores antes del ptarting. Preparar un gradiente de densidad continuo mediante la mezcla de 13 ml de Percoll, 13 ml de tampón 2x ​​CIB, y 5 mg de glutatión en un tubo de centrífuga de 50 ml, y centrifugando la mezcla a 43.000 xg durante 30 min (freno off) a 4 ° C. Después de la centrifugación, el tubo de manejar con cuidado para no perturbar el gradiente y mantener en hielo para su uso posterior. Transferir 100 ml de 1x CIB por genotipo / condición a un vaso de 1 litro. Retire las plantas de semillero del medio líquido inclinando ellos en un tamiz, y transferirlos a otro vaso de precipitados que contiene CIB-; a continuación, enjuagar el tejido con el CIB para eliminar cualquier medio líquido residual antes de reemplazarlo con 100 ml de CIB fresco. Para la homogeneización, utilizar un total de 100 ml de 1x CIB por muestra en cinco rondas consecutivas de homogeneización, cada ronda utilizando 20 ml de CIB frescas presentes en un vaso de 50 ml. Para la primera ronda de la homogeneización, se transfiere el tejido de la planta en el vaso de precipitados 50 ml con la mano, permitiendo que eltampón de retención anterior se escurra entre los dedos. Trate de usar la mayor parte del tejido en la primera ronda, pero asegúrese de que está inmerso con tampón; si esto no es posible, introducir el tejido remanente no utilizado en la segunda ronda. Coloque la sonda del homogeneizador de tejidos en el tejido y homogeneizar con dos pulsos de 1 – 2 s cada uno. Filtrar el homogenato a través de dos capas de tela de filtración en un ml tubo 250 de la centrifugadora por compresión suave. Conservar el filtrado, y transferir el tejido de nuevo a la 50 ml vaso de precipitados. Colocar una segunda alícuota de 20 ml CIB en el vaso de precipitados de 50 ml, añadir cualquier tejido remanente no utilizado en la primera ronda de homogeneización, y repita los pasos de homogeneización y de filtración. Por lo tanto, repita los pasos 3.5 y 3.6 hasta que todo el 100 ml de CIB se ha agotado (es decir, 5 partes alícuotas de 20 ml), y se combinan los filtrados resultantes. Centrifugar el homogeneizado agrupado a 1000 × g durante 5 min (freno) a 4 ° C, y se vierte fuerael sobrenadante inmediatamente después de la terminación de la centrifugación, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Resuspender el precipitado en el sobrenadante residual que queda en el tubo agitando suavemente el tubo en hielo. No volver a suspender vigorosamente con la pipeta o vortex. transferir suavemente el homogeneizado en la parte superior de la gradiente de densidad continuo preparado de antemano, usando una pipeta Pasteur para aplicarlo a través de la pared del tubo de recepción. No perturbar el gradiente. Centrífuga en un rotor oscilante-cubo en 7.800 × g durante 10 minutos (freno desactivado) a 4 ° C. NOTA: Dos bandas verdes se pueden ver en el gradiente después de la centrifugación: la banda inferior contiene cloroplastos intactos, y la banda superior contiene cloroplastos rotos. Desechar la banda superior con la pipeta, y luego transferir la banda inferior con una pipeta Pasteur en un tubo de centrífuga de 50 ml fresco, manteniendo un volumen de hasta 8 ml por gradiente. Añadir ~ 25 ml de 1x HMS tampón en el tubo e invertir el tubo dos veces to lavar el Percoll de los cloroplastos. Se coloca el tubo de nuevo en el rotor oscilante-cubo y se centrifuga a 1000 × g durante 5 min (freno) a 4 ° C. Retirar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el sedimento de cloroplasto en los HMS residual que queda en el tubo agitando suavemente el tubo en hielo. Añadir un adicional de 100 – 300 l de HMS si es necesario (en función del tamaño de la pastilla y el recuento en la Sección 4), pero trata de no diluir la muestra demasiado. Mantenga los cloroplastos en hielo. Cada vez antes de que los cloroplastos se utilizan para aplicaciones posteriores, agitar el tubo para resuspender ellos. Siempre use una punta de pipeta de corte (con un poro ampliada) para transferir los cloroplastos. 4. Análisis del rendimiento y integridad de los cloroplastos Añadir 5 l de cloroplastos aislados a 495 l de tampón de 1x HMS en un tubo de 1,5 ml, y después mezclar suavemente invirtiendo el tubo para obtener una dilución 1: 100. Place una cubierta de vidrio en la parte superior de la cámara de recuento del hemocitómetro. Lentamente pipeta ~ 40 – 60 l de la suspensión de cloroplastos se diluye en el espacio entre el vidrio de cubierta y la cámara de recuento. Utilizando un microscopio de contraste de fases con un objetivo de 10X o 20X, cloroplastos intactos miran redonda y brillante y están rodeadas por un halo de luz. NOTA: Bajo el microscopio, hay una zona de conteo de 1 mm 2 con 25 cuadrados grandes, cada uno con 16 pequeños cuadrados en el centro de la cámara de recuento. Contar el número de cloroplastos en 10 cuadrados grandes. El número de cloroplastos por gran plaza debe ser en promedio entre 10 y 30. Si es demasiado o demasiado pocos cloroplastos están presentes, ajustar el factor de dilución (paso 4.1 anterior) en consecuencia, y repita el procedimiento. Calcular el número de cloroplastos por ml (concentración) como sigue: n (el número medio de cloroplastos por gran cuadrado calculado en el paso 4.3) x 25 (número total de cuadrados grandes) × 100 (el factor de dilución) x 10 4 (factor de escala para expresar datos por 1 ml, ya que el volumen por encima de los 25 cuadrados es 0,1 mm 3). Calcular el rendimiento real de los cloroplastos multiplicando la concentración por el volumen de la suspensión de cloroplastos obtenido en la etapa 3.12. Normalmente, más de 50 × 10 6 cloroplastos se pueden obtener. 5. cloroplasto importación de proteínas Preparar las siguientes soluciones madre: Preparar tampón 10x HMS: 500 mM de HEPES, 30 mM de MgSO4, y sorbitol 3,0 M; ajustar el pH a 8,0 con NaOH. Preparar 50 ml de este tampón, alícuota y se almacena a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo y a 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo. Preparar importación tampón de detención: EDTA 50 mM disuelto en tampón 1x HMS. Preparar 50 ml de este tampón, alícuota y se almacena a -20 ° C. Preparar 2x tampón de proteína de carga: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) de glicerol, 2% (w/ V) SDS, 0,005% (w / v) de azul de bromofenol. Hacer 50 ml y se almacena a 4 ° C. Justo antes de su uso, añadir 100 l de 1 M de 1,4-ditiotreitol (DTT) a 900 l de tampón. Para ejecutar un transcurso de tiempo de 3 puntos de tiempo, preparar 3 tubos que contienen cada una alícuota de 130 l de tampón de parada de importación, y dejarlos en el hielo. Preparar una reacción de importación de 450 l en un tubo de 2 ml (por genotipo / condición). Descongelar todos los ingredientes justo antes del uso. Por una reacción de importación, por lo general utilizar 10 × 10 6 cloroplastos en un volumen l; por ejemplo, si la concentración del cloroplasto es 2,5 × 10 8 / ml, utilizar 40 l de suspensión de cloroplastos. Tres puntos de tiempo necesitarán 3 × A l (es decir, 120 l en nuestro ejemplo). Mezclar los componentes de las reacciones en hielo en el siguiente orden: agua destilada (para hacer el volumen total de 600 l), tampón B l 10x HMS (donde B = [600-3 × A] / 10; es decir, 48 en nuestro ejemplo), 12 lÁcido 1 M glucónico (sal de potasio), 6 l 1 M NaHCO 3, 6 l 20% (w / v) de BSA, 30 l de adenosina 100 mM 5'-trifosfato de sal de magnesio (MgATP), 24 l de metionina 250 mM (no radiomarcado ), y 30 l precursor de la proteína. Inmediatamente antes de iniciar la reacción de importación, añadir 3 × A l de cloroplastos y mezcle golpeando suavemente el tubo. Incubar el tubo de reacción a 25 ° C en un baño de agua a 100 mol · m – 2 · s – 1 luz. De vez en cuando chasquear los tubos para volver a suspender los cloroplastos. Para llevar a cabo un transcurso de tiempo, retirar 130 alícuotas de la reacción en los puntos de tiempo requeridos dentro del rango lineal de importación, que para pPsaD es hasta ~ 12 min (4, 8 y 12 min puntos temporales son adecuados en este caso). El período de intervalo lineal puede variar para diferentes proteínas 14. Por lo tanto, se sugiere para probar cada preproteína individual antes para optimizar tSeñala tiempo. Inmediatamente después de la retirada, traslado cada alícuota de 130 l a un tubo de tampón de detención importación enfriado con hielo, mezclar golpeando suavemente el tubo y retener todos los tubos en hielo hasta que el tiempo de curso se ha completado. Centrifugar las muestras durante 30 s a 12.000 xg en una microcentrífuga, desechar el sobrenadante con la pipeta, y volver a suspender las bolitas en 15 l de 2x tampón de carga de proteínas mediante agitación. Analizar todas las muestras y además el control de entrada pPsaD (que contiene pPsaD equivalente al 10% de la cantidad añadida a cada reacción de importación, desde el paso 2.7) por la norma SDS-PAGE y autorradiografía, fluorografía o formación de imágenes de fósforo 15. Utilice el software de análisis de imágenes para cuantificar y analizar los resultados. Para proporcionar una indicación de la eficiencia de importación, la cantidad de proteína importada en diferentes genotipos / condiciones se puede evaluar mediante la medición de la radiactividad asociada con cada banda madura.