遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

これらのプロトコルで実行されるすべてのマウス作業は、動物のプロジェクトライセンス6965分の70の下で動物科学的手続法、英国に従って実施しました。 1.レトロウイルスの生産進む前に遺伝的に改変された生物および哺乳動物細胞におけるレトロウイルスの使用を製造するために必要なすべての承認を取得。 HEK 293T細胞の増殖 HEK 293Tの（10％ウシ胎児血清（FBS）を有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、100単位/ mlのペニシリン0.1mg / mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン）培地中で10cmの組織培養皿上でHEK 293T細胞を成長させます。彼らは培地を除去し、新鮮なHEK 293T培地でプレートから細胞をピペットでコンフルエンスに達したときに、一般的な細胞継代、分割セル1時10分のため。 注：細胞は2-3日でコンフルエンスに到達する必要があります。 293T HEK細胞は、そのようにトリプシン処理が必要とされていないプレートに緩く取り付けます。 トランスフェクションの前に24時間は、conflueを分割しました翌日、細胞が約50％コンフルエントになるように、10cmプレート（トランスフェクションあたり1プレート）への細胞1:10 ntのプレート。 リン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクション トランスフェクションの前に約1時間、細胞から培地を除去し、慎重にプレートから取り外した細胞を防止するために、新鮮なHEK 293T培地の9ミリリットルを追加します。 表1に記載されているように2倍のHepes緩衝生理食塩水（2×HBS）と新鮮2.5 MのCaCl 2溶液を調製します。解凍するDNA取り揃えております。最も効率的なトランスフェクションのためのプラスミドプレップ品質のDNAを使用しています。 6ミリリットルの丸底または15ミリリットルの円錐管では、レトロウイルスDNA（PMIG）4、ヘルパーウイルスDNA（PCL-エコ）7、およびH 2 O 420μlで5μgの5μgのを追加します。 500μlのへの最終的なボリュームをもたらす2.5 MのCaCl 2の80μLを加えます。 注：このを次のステップ（2×HBSの付加）と一緒に、一般的なアイドルマスターする限り、通常のベンチで行うことができますIleの技術が使用されています。 解決策は、継続的に混合されるとカーポ4は偶数サイズの結晶中に析出するように穏やかにボルテックスしながら、ゆっくりと上記のDNA混合物にドロップすることにより2倍HBS降下の500μlを添加します。 組織培養フードに移し、ゆっくりたCaPO 4 DNA混合物（1ミリリットル）を追加し、常に、静かにプレートを旋回しながら細胞をカバーする培地の9ミリリットルに滴下。再びプレートから細胞を剥離しないように注意してください。バックインキュベーターにセルを配置します。 注：この時点でたCaPO 4沈殿物が細菌のサイズに関する小さな結晶として顕微鏡下で容易に見えるようになります。これらは容易に結晶がプレートの底に沈殿する機会があったときに30〜60分後に見られています。 培養上清におけるウイルスのコレクション。 （どこでもトランスフェクション後12-24時間から）次の日、培地を除去し、10mlの細胞を養います新鮮なHEK 293T媒体の再びプレートから細胞を除去しないように注意してください。 注：これは、HEK 293T細胞は、トランスフェクション時に培地中に分泌するリンパ球の阻害物質を希釈します。 二日目の夜に（〜24時間後、トランスフェクション）新鮮なHEK 293T培地の3.5ミリリットルで細胞を養います。一方の側をドライ残さないようにプレートをインキュベーター内で正確にレベルを置かれていることに注意してください。 培地を収集〜12時間後（4℃で保存）、新鮮なHEK 293T培地の3.5ミリリットルで食べます。およそ12時間間隔で繰り返しコレクション2回以上、約10 mlの培地のが収集されるようになっています。これは、ウイルスストックです。 5分間、600×gで遠心分離することにより、任意の残留HEK 293T細胞と細胞破片をスピンアウト。あるいは、結合0.45μmの低タンパク質、シリンジフィルターを用いてフィルター。 4℃で、そして最高の力価のStoreウイルス、力価はゆっくりと4℃で減少するように、一日か二日以内に使用します。 frとしないでくださいeezeは、このように大幅に力価が低下します。 プライマリナイーブCD4 + T細胞の2の単離 白血球細胞の単離 頸椎脱臼、CO 2窒息、または機関の動物取扱規則に適切な他の人道的なプロトコルでマウスを安楽死させます。 たて安楽死させたマウスを解剖し、脾臓および希望リンパ節15を除去します。 R10培地（10％FBS熱不活性化、100単位/ mlペニシリン、0.1mg / mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および0.1％βメルカプトエタノールを含むRPMI培地）を含む6ウェル組織培養プレートのウェル中に臓器を置きます。培養物中の汚染の機会を最小限にするために、マウスおよびそれ以降のすべての操作の解剖のための細胞培養フードを使用してください。 注：冷たいR10媒体を保持し、4℃で、すべての下流の精製の手順を実行します。 5に70μmの細胞培養ストレーナーを配置R10媒体の約5ミリリットルを含む0ミリリットルコニカルチューブ。最大3匹のマウスの脾臓およびリンパ節のための1つのストレーナを使用します。 セルストレーナーに脾臓およびリンパ節を追加し、5ミリリットルのシリンジプランジャの先端を使って柔らかく。 R10培地1〜2mlので洗い流してください。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移し、R10と14ミリリットルまでのボリュームをもたらします。 4℃で5分間、600×gで遠心分離します。細胞ペレットを乱さないようにする1清潔な動きでそれをオフに注ぐことによって、上清を捨てます。 各チューブに冷（4℃）赤血球溶解緩衝液（ 表1）を2mlを加えます。静かにチューブを氷上に維持し、3.5分間混合します。 注：赤血球溶解のタイミングは、リンパ球の死を防ぐことが重要です。したがって、赤血球溶解緩衝液の各バッチの正確なタイミングが最適化される必要があります。 R10培地の≈12-13ミリリットルを追加します。直ちに遠心分離し、ステップ2.1.5のように上清を捨てます。もっとウィット約2倍の洗浄工程を行いますH R10培地を細胞から残留赤血球溶解緩衝液を除去し、リンパ球の死を回避します。 生細胞の収率を決定するために、トリパンブルーで1:20に希釈し、血球計数器で細胞をカウントします。マウス当たり約8-10×10 7細胞を期待しています。 CD4 + T細胞、CD8 +を削除するために磁気ビーズにキットを使用して、のCD11b +、CD16 / 32 +、CD45R +、MHCクラスII +とのTer-119 +細胞の単離。 アリコートステップ8から10×10 7細胞2.1.8 15あたりミリリットルコニカルチューブおよび4℃で5分間、600×gで遠心。細胞ペレットを乱さないようにする1清潔な動きに上清を捨て。 FBSは、その後キットから抗体混合物の100μlを添加する熱不活性化の100μlの各チューブで細胞を再懸濁します。ローラ上穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベートします。 上記細胞がインキュベートされている一方で、ビーズを準備。 > 30秒間ボルテックスすることによりバイアル中で再懸濁ビーズは、その後、15ミリリットルコニカルチューブに8-10×10 7に調製した細胞あたりのビーズの1ミリリットルを転送します。ビーズ1ml当たりR10培地2mlを加え、穏やかに混合。 上清を捨てた後、1分間磁石にチューブを置きます。磁石からチューブを外し、R10培地4mlにビーズを再懸濁します。ビーズのこの量は、インキュベーションの2ラウンドのために十分です。 チューブ当たりR10培地10mlを添加することにより、抗体インキュベーション（ステップ2.2.1）の終了時に細胞を洗浄します。静かに4℃で5分間、600×gでチューブと遠心分離機細胞の旋回とよく混ぜます。細胞ペレットを乱さないようにする1清潔な動きに上清を捨て。 R10培地1mlで細胞を再懸濁し。 抗体処理した細胞の各管に（各チューブのために用意量1/2）ステップ2.2.2.2からの洗浄したビーズの2ミリリットルを追加し、ROに穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベート充填剤。 静かに狭い先端開口を含むピペットで5回ピペッティングすることにより細胞 – ビーズ混合物を再懸濁します。発泡は避けてください。新しいチューブにマイナスに、選択された細胞を含む上清を転送後、2分間ビーズ磁石にチューブを置きます。彼らはCD4 +集団であるとして、これらの細胞を保管してください。 負の選択をもう一度繰り返します。 4℃で5分間、600×gでステップ2.2.5から細胞をスピン。 R10培地1ml中のステップ2.2.3および再懸濁のように上清を捨てます。フォローは再び2.2.4と2.2.5を繰り返します。最終的な磁気ビーズ選択後、（典型的な収率は10 8の白血球当たり15-20×10 6細胞である）回収率を決定するために、細胞をカウントします。 細胞分離カラムを使用して-ナイーブCD4 + T細胞（およびCD62L 高 CD25）の単離 の150〜200μlの中で遠心分離したCD4 + Tは、4℃で5分間、600×gで細胞を再懸濁10 8個の細胞当たりR10培地。株式ビオチン化CD25モノクローナル抗体（クローン7D4）の2μlを添加します。ローラ上穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベートします。 細胞分離カラム緩衝液（ 表1）を10mlを添加することによって細胞を洗浄します。 4℃で5分間、600×gで遠心分離します。できるだけ多くの上清を除去し、残りのバッファ/細胞の量を推定します。 10 7個の細胞あたり約90μlの最終体積に再懸濁します。 10 7個の細胞あたりストレプトアビジンビーズの20μl加え、穏やかにフリックして混ぜます。 4℃で15分間インキュベートします。 細胞がインキュベートされていますが、手動のアプローチのための媒体細胞分離（MS）のカラムを準備します。各MSカラムは、10 7個の細胞を保持し、以降CD25 +細胞は、典型的には10 8のCD4 + T細胞あたり1列を使用し、総CD4 +細胞の約10％を占めます。列に細胞分離カラム緩衝液500μlを追加そして、を通して流します。さらに2回繰り返します。 細胞/ビーズインキュベーションの終わりに、細胞分離カラムを緩衝液10mlを添加し、4℃で5分間、600×gで遠心分離して細胞を洗浄します。 10 8個の細胞あたりの細胞分離カラムを緩衝液500μl中で細胞を再懸濁したが、少数の細胞が存在する場合、まだ500μLを使用します。 列にセル/ビーズ懸濁液の500μlのを適用し、フロースルーを収集します。 1列目より時間をかけてこれを通過し、再び通る流れを集めます。回収した細胞に、これらのリンスからを通じて各フローを追加し、細胞分離カラム緩衝液500μlでカラムを3回洗浄します。これらは、CD25である-細胞。収量を決定するために、細胞をカウントします。 Tregsの（CD25 +細胞）を希望する場合は、次のように分離します。 セパレーターから列を削除し、無菌性を維持するために注意しながら、オープンユニバーサルチューブの上にそれを保持します。迅速COL上に細胞分離緩衝液500μlをピペットUMNしっかりと列に付属のプランジャーを使用して、陽性画分を洗い流します。 フラッシング手順をさらに2回繰り返します。新鮮なMS細胞分離カラムに陽性画分を渡し、このフロースルーを捨てます。しっかりとR10培地1ml中に4℃で再懸濁細胞で5分間、600×gで前と遠心細胞として陽性細胞を3回、洗い流すと収量を決定するためにカウントされます。 CD62L high T細胞、遠心分離機CD25 – – 10 7個の細胞当たりR10培地の150〜200μlの4度再懸濁で5分間600×gでステップ2.3.6で上記の単離されたT細胞CD25を入手します。 CD62Lモノクローナル抗体（クローンMEL-14）をビオチン化株式の5μlを添加して、以前のようにローラー上に穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベートします。 Treg細胞単離プロトコール（2.3.7）に記載のように洗浄を行い、ストレプトアビジン結合ビーズ、および細胞分離カラムの準備。この時間の使用10 8個の細胞の容量を有する大きな細胞分離（LS）カラム。 10 8個の細胞あたり1 LS細胞分離カラムを使用して、細胞- CD62L high T細胞は、典型的には、CD25の約60〜70％を表しているからです。ステップ2.3.6で説明したように、LSの細胞分離カラムへの細胞/ビーズ混合物を追加 – カラムはリンスを通って、この時間は、最終的な流れを廃棄します。 CD25 +細胞の収集のためのステップ2.3.7で説明したようにCD62L high T細胞を収集します。 R10の1ミリリットル中に4℃で再懸濁細胞で5分間600×gで遠心分離細胞と収量を決定するためにカウントされます。 R10培地1ml当たり0.75から1 X10 6個の細胞に希釈します。 蛍光活性化細胞選別（FACS）によって細胞の純度を分析します。 FACS染色戦略 CD4-FITC、CD8a-PerCPを-のCy5.5（ヘルパーおよび細胞傷害性T細胞）、およびMHCIを有する細胞の分離のすべての段階を前後、染色I-PE（MHCクラスII発現細胞）。 細胞についてはCD25アイソレーション、CD4-FITCおよびCD25-PE（他のヘルパーT細胞に対するTregの）で汚れを前後。 CD4-FITC、CD62L-PEと（メモリやエフェクターヘルパーT細胞対ナイーブ）CD44-APCによる前細胞と後のCD62L分離染色のため。 各分析の場所のための96ウェルU底プレートのウェル中の10 5個の細胞。 4℃で5分間、600×gで遠心分離します。メディアをオフに注ぎ、200μlのDPBSで細胞を1回洗浄します。遠心分離は、上記のようにし、DPBSをオフに注ぎます。 ウェルあたりDPBS50μlの各抗体の0.5μlを添加し（2.4.1に示されるように）と蛍光標識の退色を避けるために、暗所で室温で30分間インキュベートします。 洗浄細胞は、2.4.2のようにDPBSで2倍、すぐに手元の楽器に特有のプロトコルおよびガイドラインを使用して、フローサイトメーターで分析します。 注記：良好な製剤の最終的な単離工程の後に、細胞の90％〜95％であろうCD62L high T細胞- CD4 + CD25です。 3.レトロウイルス活性化CD4 + T細胞の形質導入および特異的Tヘルパーサブセットへの分化 レトロウイルス導入 注：レトロウイルスの統合と遺伝子の発現は、細胞分裂を必要とします。したがって、T細胞は、O / Nを有効にする必要があります。 ナイーブT細胞を、DPBS中で希釈した抗CD3および抗CD28抗体でコート24ウェル組織培養プレートを単離します。ウェルあたり250μlのを追加します。 1μgの/ mlの抗抗CD3を使用してください。細胞は最終的にTh0の、のTh1、Th2およびiTregs条件で区別される場合を2μg/ mlで抗CD28を使用します。 TH9とTh17の条件については10μg/ mlで抗CD28を使用してください。組織培養インキュベーター中、37℃で約2時間インキュベートします。 直前に細胞を培養し、unbouを除去するために、抗体溶液を除去し、ウェルのDPBS〜250μlのプレートを洗浄ND抗体。プレートはそのように一度に6ウェルの最大を処理乾かす入らないように注意してください。 DPBSで洗浄し、1mlあたり0.75から1×10 6個の細胞でR10培地中のナイーブCD4 + T細胞の1ミリリットルを追加、削除。細胞O / N（14-16時間）をアクティブにします。 30℃で5分間、900×gでプレートで翌日、遠心細胞がウェルの底に細胞を付着させます。 収集した細胞を置換しないように注意してメディアを保存し、ウイルス産生プロトコルから調製された1ミリリットルのウイルス培養上清と交換してください。細胞がそのように一度に4つのウェルの最大を処理乾かすせてはいけません。 それぞれによくウイルスの取り込みを助け、次の遠心分離中に周囲のCO 2の大幅なアルカリ化を防ぐために、8 mg / mlでポリブレンの1μlを、そして1M HEPES pH7.5の10μlのを追加します。 30℃で90分間、900×gでプレート内の細胞を遠心 具体への細胞の分化FICサブセット慎重に、ウイルス培養上清を除去し、それはIL-2および他のT細胞増殖因子が含まれているとして、ステップ3.1.4で上記集め培地1mlと交換してください。特定のサブセットに細胞を区別するために3-4日間表2および培養細胞で示された試薬を追加します。 細胞の分析 サイトカインの細胞内染色のために、1 / mlのホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）およびイオノマイシンの各4時間で細胞を扱います。刺激の最後の2時間の間に、ブレフェルジンAの1 / mlのを追加します。 ピペッティングにより数回ダウンし、各ウェルの底から細胞を再懸濁し。固定および染色のために（Th細胞の培養物1mlから通常100μl）を96ウェルU底プレートに約10 5個の細胞を転送します。 より長いインキュベーション時間がGFP Aを漂白れるようにGFP染色のために、正確に5分間RTで2％パラホルムアルデヒド100μlで細胞を固定NDのFoxp3染色を妨害します。 5分間22℃で600×gで各ウェル遠心分離機にDPBS100μlを加えることによって、細胞を洗浄。上清を捨て。 注意：パラホルムアルデヒドは有毒です。皮膚や眼の保護とヒュームフードでそれを扱います。 再びのFoxp3染色キット（希釈剤の3ボリュームへの固定バッファの1の体積）から作られた100μlの1×固定バッファーを用いて細胞を固定します。 RTで45分間、細胞をインキュベートするか、あるいは16時間4℃でインキュベートします。 固定後、同キットの透過化緩衝液100μlを添加することにより細胞を透過性。その後、5分間22℃で600×gで遠心分離し、30〜45分間室温でインキュベート。 抗体染色のために、固定/透過化緩衝液を除去し、新鮮な透過化緩衝液50μlを追加します。サンプルあたり50μlのバッファーあたり0.5μlので透過化緩衝液で希釈し、必要な抗体を追加します。インフルエンザの漂白を避けるために、暗所で室温で30-45分間インキュベートorescentラベル。 5分間22℃で600×gで150μlの透過化バッファと遠心を追加します。透過化バッファーを捨て、200μlのDPBSを追加します。手元の楽器に特有のプロトコルおよびガイドラインを使用して、フローサイトメーターで分析します。 注： など 、非アクティブ化またはTh0を活性化した細胞を分析し、アイソタイプコントロール抗体での染色としてサイトカイン染色のための適切なコントロールを含めるようにしてください