Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

Todo el trabajo realizado ratón en estos protocolos se llevó a cabo de acuerdo con los Procedimientos Animales Científicas Ley, Reino Unido en virtud del animal Licencia del Proyecto 70/6965. 1. Producción retroviral Antes de proseguir obtener todas las aprobaciones requeridas para la producción de organismos modificados genéticamente y el uso de los retrovirus en células de mamífero. El crecimiento de células HEK 293T Se cultivan las células HEK 293T en 10 cm placas de cultivo de tejido en medio HEK 293T (de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades / ml de penicilina 0,1 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina) . Para los pasos celulares general, las células divididas 1:10 cuando alcanzan la confluencia retirando medio y pipeteando las células de la placa con medio fresco HEK 293T. NOTA: Las celdas deben llegar a la confluencia en 2-3 días. Las células HEK 293T se unen débilmente a la placa de modo tripsinización no es necesario. 24 horas antes de la transfección, dividir un conflueplaca nt de las células 1:10 a una placa de 10 cm (una placa por transfección) para que el día siguiente, las células son ~ 50% de confluencia. La transfección por el calcio de precipitación con fosfato Aproximadamente 1 h antes de la transfección, eliminar medio de las células y añadir cuidadosamente 9 ml de medio de HEK 293T fresco para evitar que las células se separe de la placa. Preparar 2x Hepes Buffered Saline (2x HBS) y una solución fresca 2,5 M CaCl 2 como se describe en la Tabla 1. Descongelar las existencias de ADN. Para las transfecciones más eficientes usar el ADN plásmido calidad de preparación. En un fondo redondo de 6 ml o 15 ml tubo cónico de añadir 5 g de ADN retroviral (pMIG) 4, 5 g de ADN de virus auxiliar (PCL-Eco) 7, y H2O a 420 l. Añadir 80 l de 2,5 M CaCl 2 con lo que el volumen final a 500 l. Nota: Esto, junto con la siguiente etapa (adición de 2x HBS) se puede hacer en un banco normal, siempre y cuando ster en generalse utiliza la técnica de ile. Añadir lentamente 500 l de 2x HBS gota a gota a la mezcla de ADN anterior mientras que suavemente vórtex de modo que la solución es continuamente mezclado y el CaPO4 precipita en cristales de tamaño uniforme. Transferencia a una campana de cultivo de tejido y se añade lentamente la mezcla de ADN CaPO4 (1 ml) gota a gota a los 9 ml de medio de cobertura de las células mientras que constantemente y suavemente remolinos de la placa. Una vez más, tenga cuidado de no separar las células de la placa. Colocar las células de nuevo en la incubadora. NOTA: En este punto el precipitado CaPO4 será fácilmente visible bajo el microscopio como pequeños cristales sobre el tamaño de las bacterias. Estos son vistos con facilidad después de 30-60 minutos cuando los cristales han tenido la oportunidad de asentarse en el fondo de la placa. Colección de virus en los sobrenadantes de cultivo. Al día siguiente (en cualquier lugar 12-24 horas después de la transfección) eliminar el medio y alimentar las células con 10 mlde medio de células HEK 293T fresco una vez más teniendo cuidado de no desalojar las células de la placa. NOTA: Este diluye las sustancias inhibidoras de linfocitos que las células HEK 293T secretan en el medio durante la transfección. En la tarde del segundo día (~ 24 horas después de la transfección) células con 3,5 ml de medio de células HEK 293T fresca alimentar. Tenga cuidado de que la placa se coloca exactamente al mismo nivel en la incubadora de modo que un lado no se quede seco. Recoger medio ~ 12 horas más tarde (se almacena a 4 ° C) y se alimentan con 3,5 ml de medio de células HEK 293T fresco. Repita la colección 2 más veces en aproximadamente 12 hr intervalos de modo que se recaba unos 10 ml de medio. Esta es la madre de virus. Girar fuera cualesquiera células HEK 293T residuales y los restos celulares por centrifugación a 600 xg durante 5 min. Alternativamente, filtrar utilizando una baja unión a proteínas, filtro de jeringa de 0,45 micras. el virus se almacena a 4 ° C, y para obtener mejores títulos, utilizan dentro de un día o dos, ya que el título disminuirá lentamente a 4 ° C. No frEeze, ya que esto disminuye significativamente el título. 2. Aislamiento de T primarias Naïve células CD4 + Aislamiento de células de leucocitos La eutanasia a los ratones por dislocación cervical, asfixia con CO2, u otro protocolo humana adecuada a las normas de manejo de animales de la institución. Diseccionar los ratones recién sacrificados y quitar el bazo y los ganglios linfáticos deseada 15. Coloque los órganos en los pocillos de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos que contenía medio R10 (medio RPMI con calor al 10% de FBS inactivado, 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina y 0,1% β-mercaptoetanol) . Use una campana de cultivo celular para la disección de los ratones y todas las manipulaciones posteriores para minimizar la posibilidad de contaminación en los cultivos. NOTA: Mantenga el medio R10 fría y llevar a cabo todas las etapas de purificación aguas abajo a 4 ° C. Coloque un cultivo de células colador de 70 micras en un 50 ml tubo cónico que contenía aproximadamente 5 ml de medio R10. Utilice uno de los colador bazo y los ganglios linfáticos de hasta tres ratones. Añadir el bazo y los ganglios linfáticos con el filtro de células y macerar utilizando el extremo de un émbolo de la jeringa 5 ml. Enjuague con 1-2 ml de medio R10. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml y llevar el volumen hasta 14 ml con R10. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante mediante el vertido de apagado con un movimiento limpio para evitar alterar el sedimento celular. Añadir 2 ml de (4 ° C) de glóbulos rojos tampón de lisis frío (Tabla 1) a cada tubo. mezclar suavemente durante 3,5 minutos, manteniendo el tubo en hielo. NOTA: El tiempo de lisis de glóbulos rojos es fundamental para evitar la muerte de los linfocitos. Por lo tanto, tendrá que ser optimizado el tiempo exacto de cada lote de tampón de lisis de glóbulos rojos. Añadir ≈12-13 ml de medio R10. Inmediatamente centrífuga y desechar el sobrenadante como en el paso 2.1.5. Llevar a cabo las etapas de lavado 2x más ingeniomedio h R10 para eliminar cualquier tampón de lisis celular rojo residual de las células y evitar la muerte de los linfocitos. Recuento de células en un hemocitómetro diluyendo 1:20 en azul de tripano para determinar el rendimiento de células viables. Esperar aproximadamente 8-10 x 10 7 células por ratón. Aislamiento de células T CD4 + usando perlas magnéticas Kit quitar CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC de clase II + y Ter-119 + células. Alícuota de 8-10 x 10 7 células de la etapa 2.1.8 por 15 ml de tubo cónico y centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Verter el sobrenadante con un movimiento limpio para evitar alterar el sedimento celular. Resuspender las células en cada tubo en 100 l de FBS inactivado por calor a continuación, añadir 100 l de mezcla de anticuerpo del kit. Incubar durante 30 min a 4 ° C con agitación suave en un rodillo. Mientras que las células anteriores están incubando, preparar las perlas. Perlas de resuspender en el vial por agitación durante> 30 sec entonces Transferir 1 ml de perlas por 8-10 x 10 7 células preparadas a un tubo cónico de 15 ml. Añadir 2 ml de medio R10 por ml de perlas y mezclar suavemente. Colocar el tubo en el imán durante 1 min entonces descartar el sobrenadante. Retire el tubo de las perlas de imán y resuspender en 4 ml de medio R10. Esta cantidad de granos es suficiente para dos rondas de incubación. Lavar las células al final de la incubación del anticuerpo (Paso 2.2.1) por adición de 10 ml de medio R10 por tubo. Mezclar suavemente y con turbulencia de las células tubulares y centrifugar a 600 g durante 5 min a 4 ° C. Verter el sobrenadante con un movimiento limpio para evitar alterar el sedimento celular. Resuspender las células en 1 ml de medio R10. Añadir 2 ml de las perlas lavadas de la etapa 2.2.2.2 (½ de la cantidad preparado para cada tubo) a cada tubo de las células tratadas con anticuerpo y se incuba durante 30 min a 4 ° C con agitación suave en un roller. Volver a suspender la mezcla de células-grano con la pipeta suavemente 5 veces con una pipeta que contiene una abertura de punta estrecha. Evitar la formación de espuma. Colocar el tubo en el imán granos por 2 min a continuación, transferir el sobrenadante que contiene las celdas seleccionadas negativamente a un nuevo tubo. Mantener estas células, ya que son la población CD4 +. Repita la selección negativa una vez más. Girar las células de la etapa 2.2.5 a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Verter el sobrenadante como en el paso 2.2.3 y resuspender en 1 ml de medio R10. Sigue los pasos 2.2.4 y 2.2.5 de nuevo. Después de la selección final de cuentas magnéticas, contar las células para determinar la recuperación (rendimientos típicos son 15-20 x 10 6 células por 10 8 leucocitos). Aislamiento de células T vírgenes CD4 + (CD25 – CD62L y alta) el uso de columnas de separación celular Centrifugar las células T CD4 + a 600 xg durante 5 min a 4 ° C y se vuelve a suspender en 150-200 l deMedio R10 por 10 8 células. Añadir 2 l de anticuerpo monoclonal CD25 Stock biotinilado (clon 7D4). Incubar durante 30 min a 4 ° C con agitación suave en un rodillo. Lavar las células por adición de 10 ml de tampón de columna de separación de células (Tabla 1). Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar la mayor cantidad posible sobrenadante y estimar el volumen de buffer / células restantes. Resuspender a un volumen final de aproximadamente 90 l por cada 10 7 células. Añadir 20 l de perlas de estreptavidina por 10 7 células y mezclar con gestos suaves. Incubar durante 15 minutos a 4 ° C. Mientras que las células están incubando, preparar las columnas de separación celular medio (EM) para el enfoque manual. Cada columna MS retiene 10 7 células, y puesto que las células CD25 + por lo general representan aproximadamente el 10% del total de células CD4 +, utilice la columna 1 por cada 10 8 células T CD4 +. Añadir 500 l de tampón de la columna de separación de células a la columnay dejar que fluya a través. Repite 2 veces más. Al final de la incubación de células / perlas, lavar las células por adición de 10 ml de tampón de columna de separación celular y centrifugación a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 500 l de tampón de la columna de separación de células por cada 10 8 células, pero todavía utilizar 500 l si hay menos células. Aplicar 500 l de suspensión de células / perlas a la columna y se recoge el flujo a través. Pasar este sobre la columna 1 hora más y se recoge el flujo a través una vez más. Lavar la columna 3 veces con 500 l de tampón de la columna de separación de células, añadiendo cada flujo a través de estos enjuagues para las células recogidas. Estos son los CD25 – células. Contar las células para determinar el rendimiento. Si se desean células T reguladoras (células CD25 +), aislar de la siguiente manera. Retirar la columna del separador y mantenerla por encima de un tubo de toma de atención universal abierta para mantener la esterilidad. pipeta rápidamente 500 l de tampón de separación de células en la colUMN y firmemente enjuagar la fracción positiva, usando el émbolo suministrado con la columna. Repetir el procedimiento de lavado 2 veces más. Pasar la fracción positiva a través de una columna de separación de células frescas MS y desechar este flujo continuo. Firmemente eliminar las células positivas tres veces, como antes y centrifugar las células a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Las células resuspender en 1 ml de medio R10 y contar para determinar el rendimiento. Para obtener CD25 – células de alta T CD62L, centrifugar el CD25 – células T aisladas anteriormente en la etapa 2.3.6 a 600 xg durante 5 min a 4 ° y resuspender en 150 a 200 l de medio R10 por 10 7 células. Añadir 5 l de anticuerpo monoclonal biotinilado CD62L Stock (clon MEL-14) y se incuba durante 30 min a 4 ° C con agitación suave en un rodillo como antes. Realizar lavado, estreptavidina grano de unión, y la preparación de la columna de separación de células como se ha descrito para el protocolo de aislamiento de Treg (2.3.7). Este uso del tiempola columna de la gran separación de células (LS), que tiene una capacidad de 10 8 células. Dado que las células T de alta CD62L normalmente representan alrededor del 60-70% de las células CD25 -, utilizar la columna de separación de células LS 1 por cada 10 8 células. Agregar la mezcla de células / perlas a la columna de separación de células LS como se describe en el paso 2.3.6 – esta vez de desechar el flujo final a través de la columna y se enjuaga. Recoger las células T de alta CD62L como se describe en el paso 2.3.7 para la recolección de células CD25 +. centrifugar las células a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Las células Volver a suspender en 1 ml de R10 y cuentan para determinar el rendimiento. Diluir hasta 0,75-1 X10 6 células por ml en medio R10. Analizar pureza de las células mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). estrategia de tinción FACS Para las células antes y después de todas las etapas de aislamiento, la mancha con la CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (células T citotóxicas y auxiliares), y MHCII-PE (MHC de clase II de células que expresan). Para las células pre y post aislamiento CD25, tinción con CD4-FITC y CD25-PE (Tregs frente a otras células T auxiliares). Para las células pre y mancha el aislamiento posterior CD62L con CD4-FITC, PE-CD62L y CD44-APC (ingenuo frente a las células de memoria y efectoras T helper). Para cada lugar de análisis 10 5 células en un pocillo de una placa de pocillos de fondo en U 96. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Se retira el medio y se lavan las células una vez con 200 l de DPBS. Centrifugadora que el anterior y se vierte fuera DPBS. Añadir 50 l de DPBS por pocillo y 0,5 l de cada anticuerpo (como se indica en 2.4.1) y se incuba a TA durante 30 min en la oscuridad para evitar la decoloración de la etiqueta fluorescente. Lavar las células 2x con DPBS como en 2.4.2 y analizan de inmediato en un citómetro de flujo a través de protocolos y directrices específicas para el instrumento a la mano. NOTA: Después de la etapa de aislamiento definitivo de una buena preparación, el 90-95% de las células seser CD4 + CD25 – células T de alta CD62L. 3. retroviral transducción de células T CD4 + activadas y su diferenciación en T específicas del ayudante subconjuntos La transducción retroviral NOTA: la integración retroviral y la expresión de genes requiere la división celular. Por lo tanto, las células T deben ser activados O / N. Mientras que el aislamiento de las células T ingenuas, recubrir una placa de cultivo tisular de 24 pocillos con anticuerpos anti-CD28 diluido en DPBS anti-CD3 y. Añadir 250 l por pocillo. Utilizar contra anti-CD3 de 1 g / ml. Utilice anti-CD28 a 2 g / ml, si en última instancia, pueden diferenciar células bajo Th0, Th1, Th2 y iTregs condiciones. Utilice anti-CD28 a los 10 g / ml para las condiciones Th9 y Th17. Incubar ~ 2 horas a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos. Justo antes de cultivar las células, eliminar la solución de anticuerpo y lavar la placa con ~ 250 l de DPBS por pocillo para eliminar unbound anticuerpo. Tenga cuidado de no dejar que la placa se seque por lo que procesar un máximo de 6 pocillos a la vez. Eliminar DPBS lavar y añadir 1 ml de células T CD4 + vírgenes en medio R10 en 0,75-1 x 10 6 células por ml. Activar las células S / N (14-16 h). Al día siguiente, centrifugar las células en la placa a 900 xg durante 5 min a 30 ° C para fijar las células al fondo de los pocillos. Recoger y guardar el medio con cuidado de no desplazar a las células, y reemplazar con 1 ml de sobrenadante del cultivo del virus preparada a partir del protocolo de producción de virus. No permita que las células se secan tan procesar un máximo de 4 pocillos a la vez. A cada pocillo añadir 1 l de 8 mg / ml de polibreno y 10 l de HEPES 1 M pH 7,5 para ayudar a la absorción de virus y prevenir la alcalinización significativo en el CO ambiente 2 durante el después de la centrifugación. centrifugar las células en placas a 900 x g durante 90 minutos a 30 ° C. La diferenciación de las células en especíFIC subconjuntos Retirar con cuidado el sobrenadante de cultivo de virus y reemplazar con 1 ml del medio recogidos anteriormente en la etapa 3.1.4, ya que contiene IL-2 y otros factores de crecimiento de células T. Añadir los reactivos indicados en la Tabla 2 y la cultura células durante 3-4 días para diferenciar las células en subconjuntos específicos. Análisis de las células Para la tinción intracelular de citoquinas, tratar las células con 1 g / ml cada uno de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina durante 4 hr. Durante las últimas 2 horas de estimulación, añadir al menos 1 mg / ml de brefeldina A. Resuspender las células de la parte inferior de cada pocillo pipeteando arriba y abajo varias veces. Transferir aproximadamente 10 5 células a una placa de fondo en U 96 (generalmente 100 l desde el 1 ml de cultivo de células Th) para la fijación y tinción. Para la tinción de GFP, fijar las células con 100 l de paraformaldehído al 2% a temperatura ambiente durante 5 minutos exactamente, como un tiempo de incubación más largo será blanquear la GFP unand interferir con la tinción de Foxp3. Lavar las células mediante la adición de 100 l de DPBS a cada pocillo y se centrifuga a 600 xg, a 22 ° C durante 5 min. Se retira el sobrenadante. Precaución: El paraformaldehído es tóxico. Manejarlo en una campana extractora con la piel y los ojos. Fijar las células otra vez utilizando 100 l de tampón 1x fijación realizada desde el equipo de tinción Foxp3 (1 volumen de tampón de fijación a 3 volúmenes de diluyente). Se incuban las células durante 45 min a TA o, alternativamente, incubar a 4 ° C durante 16 hr. Después de la fijación, permeabilizar las células mediante la adición de 100 l de tampón de permeabilización de la misma kit. Incubar a temperatura ambiente durante 30-45 min y centrifugar a 600 xg, a 22 ° C durante 5 min. Para la tinción de anticuerpos, eliminar el tampón de fijación / permeabilización y añadir 50 l de tampón de permeabilización fresco. Añadir el anticuerpo requerido diluido en tampón de permeabilización a 0,5 l por 50 l de tampón por muestra. Incubar durante 30-45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad para evitar la decoloración de la gripeorescent etiqueta. Añadir 150 l de tampón de permeabilización y se centrifuga a 600 xg, a 22 ° C durante 5 min. Desechar el tampón de permeabilización y añadir 200 l de DPBS. El análisis en un citómetro de flujo a través de protocolos y directrices específicas para el instrumento a la mano. NOTA: Asegúrese de incluir controles adecuados para la tinción de citoquinas tales como la tinción con anticuerpos de control de isotipo, el análisis de las células no activadas o Th0 activados, etc.