Ретровирусное трансдукция Т-хелперы как генетический подход к изучению механизмов, контролирующих их дифференцировку и функции

Все работы мыши выполнены в этих протоколах была проведена в соответствии с процедурами Животные научных Закона, Великобритании в соответствии с лицензией 70/6965 проекта животного. 1. Производство Ретровирусное Перед продолжением получения всех необходимых согласований для получения генетически модифицированных организмов и использование ретровирусов в клетках млекопитающих. Рост клеток НЕК 293Т Grow 293Т HEK на 10 см чашки для культивирования тканей в НЕК 293T среде (среда Игла, модифицированная орла Средний (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина 0,1 мг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) , Для общего прохождения клетки, клетки расщепленные 1:10, когда они достигают слияния путем удаления среды и пипеткой клетки от пластины со свежей средой НЕК 293T. Примечание: Клетки должны достичь слияния в течение 2-3 дней. 293T НЕК клетки придают неплотно к пластине так трипсинизации не требуется. 24 ч до трансфекции, разделить conflueнт пластинка клеток от 1:10 до 10 см пластины (одна пластина на трансфекцией), так что на следующий день клетки ~ 50% сплошности. Трансфекция по фосфатом кальция Осадки Приблизительно 1 ч до трансфекции удалить клетками среду и осторожно добавляют 9 мл свежей среды НЕК 293T, чтобы предотвратить клетки отвязывания от пластины. Готовят 2x Hepes – солевом буферном растворе (2x HBS) и свежий 2,5 М CaCl раствора 2 , как описано в таблице 1. Растаяйте запасы ДНК. Для получения наиболее эффективных трансфекциях используют плазмиду качества Prep ДНК. В 6 мл с круглым дном или 15 мл коническую трубку добавляют 5 мкг ДНК ретровирусов (pMIG) 4, 5 мкг ДНК вируса Helper (ПКЛ-Eco) 7 и H 2 O в 420 мкл. Добавляют 80 мкл 2,5 М CaCl 2 , доведя конечный объем до 500 мкл. Примечание: Это наряду со следующим шагом (добавление 2x HBS) может быть сделано на регулярной скамейке до тех пор, как общая STERIle метод используется. Медленно добавляют 500 мкл 2x HBS по каплям к вышеуказанной смеси ДНК, осторожно встряхивая таким образом , чтобы раствор непрерывно перемешивают и каподастра 4 осаждается в даже размера кристаллов. Перенесите в капот культуры ткани и медленно добавляют смесь ДНК CaPO 4 (1 мл) по каплям 9 мл среды , покрывающих клетки в то время как постоянно и осторожно закрученной тарелку. Еще раз быть осторожным, чтобы не отделить клетки от пластины. Поместите клетки обратно в инкубатор. Примечание: В этот момент осадок CaPO 4 будет легко видны под микроскопом в виде мелких кристаллов размером с бактериями. Они хорошо видны через 30-60 мин, когда кристаллы имели возможность осесть на дно тарелки. Сбор вируса в культуре супернатантов. На следующий день (где-то от 12-24 ч после трансфекции) удаления среды и питания клеток с 10 млсвежего НЕК 293T среды еще раз осторожно, чтобы не сместить клетки от пластины. ПРИМЕЧАНИЕ: Это разбавляет из лимфоцитов ингибирующие вещества, что НЕК 293T клетки секретируют в среду во время трансфекции. Вечером второго дня (~ 24 часов после трансфекции) кормить клеток с 3,5 мл свежей среды НЕК 293T. Будьте осторожны, чтобы пластина помещается ровно уровень в инкубаторе, так что одна сторона не осталась сухой. Сбор среды ~ 12 час позже (хранить при температуре 4 ° С) и кормить с 3,5 мл свежей среды НЕК 293T. Повторите сбор 2 раза больше примерно в 12 интервалов ч так, что собрано около 10 мл среды. Это вирус запас. Спин любые остаточные НЕК 293Т и клеточного дебриса центрифугированием при 600 х г в течение 5 мин. В качестве альтернативы, фильтр с использованием 0,45 мкм, низкое связывание с белками, шприцевой фильтр. Вирус Хранить при температуре 4 ° С, а для достижения наилучших титрами, использовать в течение дня или двух, так как титр будет медленно уменьшаться при 4 ° С. Не FrEeze, так как это существенно снижает титр. 2. Выделение первичной Наивные CD4 + Т – клеток Выделение лейкоцитарной клеток Эвтаназии мышей путем смещения шейных позвонков, CO 2 удушья или других гуманного протокола соответствующего правилам обращения с животным учреждения. Рассеките свеже эвтаназии мышей и удаления селезенки и лимфатических узлов желательно 15. Поместите органы в лунки 6-луночные тканевого культурального планшета, содержащей среде R10 (RPMI среду с 10% инактивированной нагреванием FBS, 100 ед / мл пенициллина, 0,1 мг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 0,1% бета-меркаптоэтанол) , Используйте для культивирования клеток вытяжку для рассечения мышей и все последующие манипуляции, чтобы свести к минимуму вероятность загрязнения в культурах. Примечание: Держите среду R10 холодной и выполнять все ниже по течению стадии очистки при 4 ° С. Поместите 70 мкм сетчатый фильтр для культивирования клеток в 50 мл коническую пробирку, содержащую приблизительно 5 мл R10 среды. Используйте один сетчатый фильтр для селезенки и лимфатических узлов до трех мышей. Добавить селезенки и лимфатических узлов на клеточный фильтр и вымачивать, используя конец поршня шприца 5 мл. Полоскание с 1-2 мл среды R10. Передача клеток в 15 мл коническую трубку и довести объем до 14 мл с помощью R10. Центрифуга при 600 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант путем заливки его с одним чистым движением, чтобы предотвратить нарушения клеточного осадка. Добавляют 2 мл холодной (4 ° C) красных клеток буфера для лизиса (таблица 1) в каждую пробирку. Аккуратно перемешать в течение 3,5 мин, держа трубку на льду. Примечание: Время проведения лизиса эритроцитов имеет решающее значение для предотвращения гибели лимфоцитов. Таким образом, точные сроки каждой партии буфера для лизиса красных кровяных телец необходимо будет оптимизировать. Добавить ≈12-13 мл среды R10. Сразу центрифуге и отбросить супернатант, как на стадии 2.1.5. Выполните стадии промывки 2x дополнительной остроумияч R10 среда для удаления остатков красного буфера для лизиса клеток из клеток и избежать гибели лимфоцитов. Граф клеток в гемоцитометра разбавление 1:20 в трипановым синим, чтобы определить выход жизнеспособных клеток. Ожидать приблизительно 8-10 × 10 7 клеток на мышь. Выделение CD4 + Т – клеток с использованием магнитных шариков Kit для удаления CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC класса II + и Тер-119 + клеток. Аликвоты 8-10 х 10 7 клеток с этапа 2.1.8 в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 600 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Слейте надосадочную с одним чистым движением, чтобы предотвратить нарушения клеточного осадка. Ресуспендируют клеток в каждой пробирке в 100 мкл инактивированной нагреванием FBS, затем добавляют 100 мкл смеси антител из набора. Инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при осторожном перемешивании на валике. Хотя вышеуказанные клетки инкубирования, готовят шарики, Ресуспендируют бусины в ампуле встряхиванием в течение> 30 сек , то передача по 1 мл шариков на 8-10 х 10 7 клеток , приготовленных в 15 мл коническую пробирку. Добавляют 2 мл среды R10 на мл гранул и аккуратно перемешать. Поместите пробирку в магните в течение 1 мин, а затем отбросить супернатант. Удалить трубку от магнита и ресуспендируют бусин в 4 мл среды R10. Это количество шариков достаточно для двух раундов инкубации. Промывают клетки в конце инкубации антитела (этап 2.2.1) добавлением 10 мл среде R10 на пробирку. Аккуратно хорошо перемешать с закрученной трубки и центрифужные клеток при 600 мкг в течение 5 мин при 4 ° C. Слейте надосадочную с одним чистым движением, чтобы предотвратить нарушения клеточного осадка. Ресуспендируют клеток в 1 мл среды. R10 Добавляют 2 мл отмытых бусинок с шага 2.2.2.2 (½ суммы, подготовленной для каждой пробирки) в каждую пробирку антитела клеток, обработанных и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при осторожном перемешивании на роМюллером. Ресуспендируют клеток шарик смесь осторожно пипеткой 5 раз с пипеткой, содержащим узким горлышком. Избегать образования пены. Поместите пробирку в магните бусами в течение 2 мин, а затем передать супернатант, содержащий отрицательно отобранных клеток в новую пробирку. Хранить эти клетки, так как они являются популяция CD4 +. Повторите негативный отбор еще один раз. Спин клетки с этапа 2.2.5 при 600 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Слейте надосадочную как на этапе 2.2.3 и ресуспендируют в 1 мл среды R10. Последующие шаги 2.2.4 и 2.2.5 снова. После окончательного выбора магнитного шарика, подсчет клеток для определения восстановления (типичные выходы 15-20 х 10 6 клеток на 10 8 лейкоцитов). Выделение Наивные CD4 + Т – клеток (CD25 – и CD62L высокого) Использование разделительной ячейки столбцов Центрифуга CD4 + Т – клетки при 600 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 150-200 мклR10 среда на 10 8 клеток. Добавьте 2 мкл биотинилированного CD25 акций моноклональных антител (клон 7D4). Инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при осторожном перемешивании на валике. Промыть клеток путем добавления 10 мл буфера дл разделени клеток на колонке (таблица 1). Центрифуга при 600 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалить столько супернатант, насколько это возможно, и оценить объем буфера / ячеек остальных. Ресуспендируют до конечного объема примерно 90 мкл на 10 7 клеток. Добавьте 20 мкл стрептавидина шариков на 10 7 клеток и смешать с мягкими щелчками. Инкубировать в течение 15 мин при температуре 4 ° С. В то время как клетки инкубирования, готовят среда для разделения клеток (MS) столбцы для ручного подхода. Каждый столбец MS сохраняет 10 7 клеток, а так как CD25 + клетки , как правило , составляют около 10% от общего числа CD4 + клеток, используют 1 колонка на 10 8 CD4 + Т – клеток. Добавьте 500 мкл буфера на колонке дл разделени клеток в колонкеи пусть текут через. Повторите еще 2 раза. В конце клетки / гранулы инкубации, мыть клетки, добавляя 10 мл колоночного буфера дл разделени клеток и центрифугирование при 600 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера дл разделени клеток колонки на 10 8 клеток, но до сих пор используют 500 мкл , если меньше клеток. Применить 500 мкл клеток / суспензионной в колонну и собирать поток через. Передайте это через колонку 1 больше времени и собрать поток через еще раз. Полоскание в столбце 3 раза 500 мкл буфера для колонки дл разделени клеток, добавляя каждый поток через из этих промывок в собранных клеток. Они являются CD25 – клетки. Граф клеток, чтобы определить выход. Если Tregs (CD25 + клетки) желательно изолировать следующим образом . Удалить столбец из сепаратора и держать его над открытым универсальной трубки Стараясь для поддержания стерильности. Быстро пипетки 500 мкл буфера для разделения клеток на седловинеитп и прочно вымывать положительную фракцию, используя поршень, поставляемый вместе с колонной. Повторите процедуру Смывании еще 2 раза. Пропускают положительную фракцию над свежей MS разделительной колонки клеток и отбросить эту проточные. Твердо вымывать позитивных клеток в три раза, как и раньше, и центрифуг клеток при 600 мкг в течение 5 мин при 4 ° С Ресуспендируют клеток в 1 мл среды R10 и считать для определения выхода. Для получения CD25 – CD62L высокие Т – клетки, Центрифуга CD25 – Т – клетки , выделенные выше в п.2.3.6 при 600 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 150-200 мкл среде R10 на 10 7 клеток. Добавьте 5 мкл акций биотинилированный CD62L моноклонального антитела (клон MEL-14) и инкубировали в течение 30 мин при температуре 4 ° С при осторожном перемешивании на ролик, как и раньше. Выполните мытье, Стрептавидином шарик связывания, и Подготовку колонки разделения клеток, как описано для протокола изоляции Treg (2.3.7). Это использование временибольшое разделение клеток (LS) колонка, которая имеет емкость 10 8 клеток. Поскольку CD62L высокой Т – клетки , как правило , составляет около 60-70% CD25 – клеток, используют 1 LS колонки разделения клеток на 10 8 клеток. Добавить Смесь клетки / гранулы в LS колонке дл разделени клеток, как описано в п.2.3.6 – на этот раз отбрасывая окончательный поток через и столбец ополаскивателей. Сбор высокие Т – клетки , CD62L , как описано в шаге 2.3.7 для сбора клеток CD25 +. Центрифуга клетки при 600 мкг в течение 5 мин при 4 ° С Ресуспендируют клеток в 1 мл R10 и рассчитывать, чтобы определить выход. Разбавить до 0.75-1 Х10 6 клеток на мл в среде R10. Анализ чистоты клеток путем флуоресцентного активированного сортировки клеток (FACS). Стратегия окрашивания FACS Для клеток до и после всех этапов изоляции, пятно с CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (хелперов и цитотоксических Т-клеток), и MHCII-PE (МНС класса II, выражающие клетки). Для клеток до и после выделения CD25, пятно с CD4-FITC и CD25-PE (Tregs по сравнению с другими Т-хелперы). Для клеток до и после CD62L изоляции пятно с CD4-FITC, CD62L-PE и CD44-APC (наивным по сравнению с памятью и эффекторных Т-хелперы). Для каждого анализа места 10 5 клеток в лунку 96 – луночного U-образным дном. Центрифуга при 600 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Слейте среды и промыть клетки один раз 200 мкл ДЗФР. Центрифуга, как описано выше, и слейте DPBS. Добавляют 50 мкл ДЗФР на лунку и 0,5 мкл каждого из антител (как указано в 2.4.1) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, чтобы избежать обесцвечивания флуоресцентной метки. Вымойте клетки 2x с ДЗФР, как в 2.4.2 и сразу же анализируют на проточном цитометре с использованием протоколов и руководящих принципов, характерных для инструмента под рукой. Примечание: После последней стадии выделения хорошей подготовки, 90-95% клеток будетбыть CD4 + CD25 – CD62L высокой Т – клеток. 3. Ретровирусное Трансдукция активированных CD4 + Т – клеток и их дифференцировку в специфические Т – хелперов подмножествах Ретровирусное Трансдукция Примечание: Ретровирусное интеграции и экспрессии генов требует деление клеток. Таким образом, Т-клетки должны быть активированы O / N. В то время как изолируя наивных Т-клеток, пальто 24 хорошо культуре ткани пластины с анти-CD3 и анти-CD28 антитела разбавленных в ДЗФР. Добавить 250 мкл на лунку. Используйте анти анти-CD3 на 1 мкг / мл. Использование анти-CD28 при 2 мкг / мл, если клетки будут в конечном счете, будет дифференцироваться под Th0, Th1, Th2 и iTregs условиях. Использование анти-CD28 в концентрации 10 мкг / мл для Th9 и Th17 условий. Выдержите ~ 2 ч при 37 ° С в инкубаторе тканевых культур. Непосредственно перед культивированием клеток, удалить раствор антител и промойте пластину с ~ 250 мкл на лунку ДЗФР для удаления unbouго антитела. Будьте осторожны, чтобы не позволить пластины высохнуть так обработать максимум 6 лунок одновременно. Удалить DPBS помыть и добавить 1 мл наивных CD4 + Т – клеток в среде R10 в 0,75-1 × 10 6 клеток на мл. Активируйте клетки O / N (14-16 ч). На следующий день, центрифужные клетки в пластине при 900 х г в течение 5 мин при 30 ° С, чтобы присоединить клетки к дну лунок. Собрать и сохранить среду, стараясь не сместить клетки, и заменить 1 мл вируса супернатанта культуры, полученного из протокола производства вируса. Не позволяйте клетки высыхают так обработать максимум 4 лунок одновременно. В каждую лунку добавляют 1 мкл 8 мг / мл полибрена и 10 мкл 1 М HEPES , рН 7,5 , чтобы помочь поглощение вирусов и предотвратить значительное подщелачивание в окружающем СО 2 в течение последующего центрифугирования. Центрифуга клетки в пластине при 900 мкг в течение 90 мин при 30 ° С Дифференциация клеток в SpeciFIC Поднаборы Тщательно удалите вирус супернатант культуры и заменяют 1 мл среды, собранных выше на этапе 3.1.4, так как он содержит ИЛ-2 и другие факторы роста Т-клеток. Добавьте реагенты, указанные в таблице 2 и культуры клеток в течение 3-4 дней, чтобы дифференцировать клетки в определенных подмножеств. Анализ клеток Для внутриклеточного окрашивания цитокинов, лечения клеток с 1 мкг / мл каждого из форболовыми 12-миристат-13-ацетата (РМА) и Ionomycin в течение 4 часов. В течение последних 2 ч стимуляции, добавляют 1 мкг / мл брефелдин A. Ресуспендируют клетки из нижней части каждой лунки с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Передача около 10 5 клеток в 96 – луночный U нижней пластины (обычно 100 мкл из 1 мл культуры клеток Th) для фиксации и окрашивания. Для окрашивания GFP, зафиксировать клетки с 100 мкл 2% параформальдегида при комнатной температуре в течение ровно 5 мин, в течение длительного времени инкубации будет отбеливать GFP Aго мешают Foxp3 окрашивания. Вымойте клеток путем добавления 100 мкл ДЗФР в каждую лунку и центрифуге при 600 мкг при 22 ° С в течение 5 мин. Слейте надосадочную. Внимание: параформальдегид является токсичным. Обращайтесь с ним в вытяжном шкафу с кожей и средства защиты глаз. Закрепить клетки снова с помощью 100 мкл буфера 1x Fixation, сделанный из комплекта для окрашивания Foxp3 (1 объем фиксирующих буфера 3 объема разбавителя). Инкубируйте клетки в течение 45 минут при комнатной температуре, или в качестве альтернативы инкубировать при температуре 4 ° С в течение 16 часов. После фиксации проницаемыми клетки путем добавления 100 мкл буфера пермеабилизации из того же комплекта. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30-45 мин, затем центрифугировать при 600 х г при 22 ° С в течение 5 мин. Для окрашивания антител, удалить фиксации / буфер пермеабилизирующего и добавить 50 мкл свежего буфера пермеабилизации. Добавить требуемое антитело, разведенное в пермеабилизации буфере при 0,5 мкл на 50 мкл буфера на образец. Выдержите в течение 30-45 мин при комнатной температуре в темноте, чтобы избежать отбеливания гриппаorescent этикетки. Добавьте 150 мкл буфера и пермеабилизирующего центрифуге при 600 х г при 22 ° С в течение 5 мин. Откажитесь буфер пермеабилизирующего и добавьте 200 мкл DPBS. Анализ на проточном цитометре с использованием протоколов и руководящих принципов, характерных для инструмента под рукой. ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте включить соответствующие элементы управления для окрашивания цитокина , таких как окрашивание с контрольными изотипа антител, анализируя неактивированной или активированными Th0 клетки и т.д.