Perturbations de circulation miARN dans le syndrome du côlon irritable détectée en utilisant un multiplexée à haut débit Gene Expression Plate-forme
Özet
We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Abstract
La plate-forme analyse d'expression génique permet une quantification robuste et hautement reproductible de l'expression de jusqu'à 800 transcrits d'ARNm (miARN) ou en une seule réaction. Le test miRNA compte transcriptions par imagerie directe et le comptage numérique des molécules de miARN qui sont étiquetés avec fluorescentes ensembles de sondes à code-barres de couleur (une sonde rapporteur et une sonde de capture). Barcodes sont hybridées directement à maturité miARN qui ont été allongés par ligature d'un marqueur oligonucléotidique unique, (miRtag) à l'extrémité 3 '. la transcription inverse et l'amplification de la transcription ne sont pas nécessaires. Reporter sondes contiennent une séquence de six positions de couleur peuplées par une combinaison de quatre couleurs fluorescentes. Les quatre couleurs sur six positions sont utilisées pour construire une séquence couleur code-barres spécifique du gène. le traitement post-hybridation est automatisée sur une station de préparation robotique. Après hybridation, les sondes en excès sont lavés, et les structures tripartites (capture probe-miARN-reporter sonde) sont fixés sur une lame revêtue de streptavidine via la sonde de capture marquée à la biotine. Imagerie et code à barres de comptage est effectué en utilisant un analyseur numérique. Les miARN sont immobilisés à code-barres visualisées et imagées en utilisant un microscope et de la caméra, et les codes-barres uniques sont décodés et comptés. contrôle de la qualité des données (QC), la normalisation et l'analyse sont facilitées par un logiciel de traitement et d'analyse de données sur mesure qui accompagne le logiciel d'analyse. L'essai démontre une linéarité élevée sur une large gamme d'expression, ainsi que de haute sensibilité. L'échantillon et la préparation de l'essai ne comporte pas de réactions enzymatiques, la transcription inverse, ou amplification; a quelques pas; et est largement automatisé, ce qui réduit les effets de l'enquêteur et résultant en grande cohérence et la reproductibilité technique. Ici, nous décrivons l'application de cette technologie pour identifier circulants perturbations miARN dans le syndrome du côlon irritable.
Introduction
Syndrome du côlon irritable (IBS) est le diagnostic ambulatoire le plus commun en gastro-entérologie, affligeant 10-15% de la population générale et qui représente un fardeau important sur les services de santé. Biomarqueurs diagnostiques Actuellement, il n'y a pas généralement accepté pour IBS (c. -à , le diagnostic repose sur les symptômes cliniques et au pouvoir d'autres troubles organiques, tels que les tumeurs gastro – intestinales, les maladies inflammatoires de l' intestin, et gastro – intestinal (GI) infections). Lors de l' étude des profils d'expression des gènes dans les conditions communes avec histopathologie subclinique, comme IBS, haute sensibilité et la précision (reproductibilité) sont nécessaires, comme des perturbations dans les profils d'expression des gènes sont souvent subtiles 1-3. miARN ont été identifiés comme les deux cibles diagnostiques et fonctionnelles dans IBS 4,5, et nous sommes particulièrement intéressés à évaluer leur utilisation comme biomarqueurs de l' IBS-associés perturbations biologiques 3,4,6,7 circulation. L'utilisation clinique de circulabiomarqueurs ting est d'actualité en raison de la facilité et de la nature peu invasive de la collection de la source de biomarqueurs (par exemple, le sang périphérique) provenant de patients.
Gene tests de plate-forme d'expression, en raison de leur composition chimique unique et rationalisé, workflow essentiellement automatisé, fournissent une plate-forme de puces à ADN qui offre une couverture large et personnalisable (800 cibles dans une seule réaction) du transcriptome pour la découverte ciblée. Ils donnent également une grande précision et linéarité sur un large éventail de niveaux d'expression dans la quantification des cibles transcriptomiques. Le dosage ne nécessite pas la transcription inverse de l'ARN, l'amplification de l'ADNc, ou d'autres réactions enzymatiques résultant. Ainsi, les erreurs éventuelles introduites par le nombre élevé de cycles d'amplification à partir d'espèces d'ARN ayant une faible abondance ou de variants d'épissage rares sont réduits par le procédé de comptage numérique. Cela signifie qu'une grande variété de types d'échantillons, tels que le total des purifiéARN (ie, ARNm + miARN), l' ARN à partir (FFPE) spécimens enrobés de paraffine fixés au formol, ainsi que des lysats de tissu brut et cellules, peut être utilisé avec les tests.
Les ARN d'intérêt sont détectés au moyen d'une paire de sondes (sondes de capture et reporteurs), chacune contenant une séquence spécifique d'une cible qui reconnaît une région correspondante de l'ARN cible. Afin d'assurer la détection des ARN courts (c. -à- miARN), la séquence miRNA mature est allongée par recuit d' un marqueur oligonucléotidique unique , (miRtag) à l' extrémité 3 'de la molécule. Un oligonucléotide de pontage, qui est complémentaire à une partie à la fois la cible mûre miRNA et la miRtag miRNA spécifique, est utilisé pour assurer une spécificité de séquence. Capture et journaliste sondes ligaturer à la 3 'et 5' extrémités du complexe miRNA-miRtag mature, respectivement. Les sondes de capture ont un marqueur de biotine à l'extrémité 3 ', qui leur permettent de se fixer à la surface d'une lame de verre revêtue de streptavidine, fixing le complexe de la sonde sonde-miARN-miRtag-reporter la capture à la diapositive. Un courant électrique est alors utilisé pour orienter le complexe sur la surface de glissement, ce qui permet des codes barres fluorescentes portées par la sonde rapporteur à l'extrémité 5 'à visualiser à l'aide d'un microscope et un dispositif à couplage de charge (CCD). Barcodes sont comptées et décodés, ce qui donne un nombre de miARN cibles spécifiques. Le code à barres fluorescent se compose de six positions qui peuvent être occupés par l'une des quatre couleurs fluorescentes, qui peuvent être utilisés pour construire plus de 4000 combinaisons couleur codes à barres, chaque codant pour un ARN spécifique.
La préparation des échantillons (c. -à- purification de l' ARN ou de cellules / tissus préparation de lysat), ainsi que l' hybridation des sondes de capture et de rapporteurs, sont effectués sur le banc. Douze échantillons peuvent être multiplexés sur une seule diapositive. Après l'hybridation pendant une nuit, tout en outre la préparation des échantillons est réalisée par une station de préparation robotisée. Les lames chargées sont ensuite transférées dans l'annonceanalyseur igital pour l'imagerie, le comptage, le décodage et le traitement des données. Les données obtenues sont importées dans le logiciel d'accompagnement, où elles sont traitées ultérieurement avec un degré élevé de contrôle de l'utilisateur. La chimie unique, préparation simple, nature automatisée, simple type de données (chiffres) et flux de travail rationalisé l'ensemble de l'essai facilitent haute précision l'expression du gène de quantification, ce qui en fait un outil utile dans l'étude de circulation des profils et des signatures d'expression miRNA dans des conditions fonctionnelles telles que IBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques dans le Protocole
Pour le dosage de miARN en particulier, il est essentiel de ne pas utiliser des lysats non purifiés (ceux-ci peuvent être utilisés dans l'ARNm et des dosages de protéine), comme les réactifs ne sont pas optimisés pour une utilisation avec des lysats et les réactions de préparation d'échantillon est susceptible d'être inhibée. En outre, les contaminants transportés sur des étapes de lyse et de purification d' ARN (par exemple, des composés de guanidinium, l' éthanol et les phénols) peuvent inhiber la ligature et la purification de l' échantillon réactions. ARN de bonne qualité est donc essentielle à la sensibilité et la précision du dosage miARN.
En utilisant un thermocycleur avec un couvercle chauffé est essentielle pour assurer un contrôle adéquat de la température pour optimiser la performance de toutes les étapes de la réaction. Lors de l'étape 3.5.1, il est important de ne pas enlever les bandes du thermocycleur afin de maintenir la température au cours de l'addition de la ligase. Retrait des bandes pour ajouter le ligasecompromettra la réaction. Lorsque vous effectuez les étapes d'hybridation, il est essentiel d'éviter une agitation vigoureuse, pipetage ou chiquenaude lors du mélange des réactifs dans les tubes, comme cela peut cisailler les sondes rapporteurs. Pour garantir des performances optimales et de cohérence, il est important de bien mélanger les réactifs dans les tubes en tapotant doucement. Toujours tourner vers le bas des réactions après le mélange, et d'utiliser une nouvelle pipette pointe chaque fois un réactif est distribué pour assurer un pipetage précis et d'éviter la contamination croisée accidentelle.
Modifications et dépannage
Les jeux de codes peuvent être personnalisés pour inclure uniquement les cibles d'intérêt. De cette façon, les coûts peuvent être équilibrés pour permettre le test des grands ensembles d'échantillons lors d'enquêtes supplémentaires ou la validation d'un bio-signature. Les sondes de mesure peuvent être conçus pour des gènes ou des cibles non disponibles dans le menu à la carte. Sensibilité des cibles moins abondantes ou l'ARN à faible concentration peut êtremanipulé en permettant un temps d'hybridation plus longues et / ou en utilisant un comptage numérique à résolution plus élevée.
Dans notre étude, nous avons utilisé la 800 cible panneau miRNA prédéfini avec l'ARN total du sang total; Cependant, les essais peuvent être personnalisés pour inclure moins de miARN si une approche plus ciblée est nécessaire. Un total de 24 échantillons peuvent être préparés en une seule journée, en quinconce dans deux ensembles de 12, parce que deux cartouches peuvent confortablement être passés à travers le traitement post-hybridation sur la station de préparation robotique et imagés sur l'analyseur numérique le jour suivant. le traitement des échantillons en quinconce par lots de 12 est important de standardiser le temps d'hybridation. Les cartouches qui ont été imagées peuvent être enregistrées et conservées à 4 ° C pour être réanalysés si des analyses de données suggèrent qu'un scan de résolution plus élevée peut améliorer la détection des miARN plus rares. La détection de molécules rares peut également être améliorée en hybridant les échantillons pendant plus longtemps; Cependant, l'hybridation prolongée peut Result en sursaturation et ne peuvent améliorer les résultats si les concentrations d'ARN de départ sont bas (comme dans l'ARN des vésicules dérivé extracellulaire). La sensibilité et la précision de la plate-forme permettent relativement miARN faible abondance à compter de manière fiable.
Limites de la technique
L'expression du gène plate-forme de test décrit ne peut accueillir jusqu'à 800 cibles par tableau. Il est donc pas adapté pour les études de transcriptome entières toute miRNA-transcriptome /. Seulement connus, décrits, et les cibles spécifiées peuvent être détectés en utilisant la plate-forme, de sorte qu'il ne convient pas à la découverte de nouvelles espèces moléculaires. D'autres méthodes, telles que RNA-seq ou d'autres méthodes de microréseaux traditionnelles, sont plus adaptés à transcriptome ensemble des études exploratoires.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
IBS est caractérisée par une combinaison de symptômes, priny compris palement douleurs abdominales; l'hypersensibilité viscérale; et les changements dans les habitudes intestinales, comme la diarrhée fréquente, la constipation, ou une combinaison des deux 9,10. Symptômes de l' IBS ont aucune cause organique connue, et les patients ne présentent pas d' une inflammation cliniquement significative, perturbations histopathologiques des tissus gastro – intestinaux, ou des marqueurs systémiques 9-12. La recherche suggère que la dysrégulation biologique dans IBS est subtile, subclinique, et hétérogène, avec des thèmes communs émergent autour de l' inflammation et la fonction immunitaire 10. Par conséquent, nous avions besoin pour contrôler la variation de expérimentateur introduit et utiliser une plate-forme qui a été capable de détecter de manière fiable des perturbations subtiles dans l'expression des gènes. Les caractéristiques uniques de l'essai et le système de normaliser le traitement des échantillons et réduire expérimentateur manipulation grâce à l'automatisation, ce qui réduit la variance technique pour produire des données hautement reproductibles. Ces caractéristiques permettent des enquêtes ciblées et produisent une grande précision et rdonnées eplicable. Ceci permet la détection des perturbations subtiles et les perturbations entre les cibles à faible expression qui peut être négligée ou submergés par les signaux de cibles plus abondants lors de l'utilisation intensity- ou à base d'amplification, des méthodes. microarrays basées sur la PCR et les méthodes sont RNA-seq alternatives viables à l'aide de la plate-forme décrite et peut être attrayant comme solution de rechange lorsque des débits plus élevés sont nécessaires ou lorsque l'objectif est de caractériser l'ensemble transcriptome ou à rechercher de nouvelles molécules. Toutefois, des alternatives peuvent ne pas fonctionner aussi bien dans la détection et la quantification des cibles rares et subtiles perturbations avec précision et sensibilité.
Applications futures ou les directions après Maîtriser cette technique
Circulant expression miRNA chez les participants IBS a montré un certain nombre de perturbations qui ont été trouvés être à la fois significative et cohérente au sein des catégories. Les miARN identifiés ont été associés à pathwa pertinentsys et conditions pathologiques, y compris une condition fonctionnelle de la douleur (miR-342-3p: la douleur chronique de la vessie) 8 et de l' inflammation (miR-150) 13. L'étude d'exemple a été basé sur une cohorte exploratoire utilisé pour définir des objectifs et des systèmes d'intérêt. Un plus ciblée, plus petite gamme miRNA a ensuite été construit, en abaissant le coût par échantillon et permettant beaucoup plus grandes cohortes à analyser d'une manière rentable afin de valider et d'affiner les signatures et les biomarqueurs. Le système de dosage de la plate – forme d'expression génique un équilibre entre la nature exploratoire traditionnelle du microréseau et plus ciblée, la collecte de données fondée sur une hypothèse pour affiner et tester les signatures et les biomarqueurs moléculaires 14-16. La méthode sera utilisée pour examiner les perturbations moléculaires et de protéines in vivo et in vitro dans des modèles où les miARN cibles décrites sont expérimentalement surexprimé ou inhibée. De nouveaux tests permettent la quantification simultanée des ARNm et proteins directement à partir de lysats cellulaires et tissulaires. En outre, en optimisant la purification de fractions spécifiques du sang périphérique et des excréta (par exemple, l' urine) et en personnalisant et en optimisant certains paramètres d'analyse, les profils moléculaires et les signatures de faibles fractions de concentration moléculaire (par exemple, des fractions exosomales) seront examinés.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
Materials
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
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