Microglies comme un biocapteur Surrogate pour déterminer Nanoparticules neurotoxicité
Özet
Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Abstract
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
Introduction
Pollutions environnementales, en particulier celles de la nanoparticule (NP) Plage (1 – diamètre 20 nm), ont été liés à l' obésité et d' autres maladies neurodégénératives en raison de la capacité à traverser la barrière hémato – encéphalique 1-3. Exposition élevée à la pollution peut induire une inflammation dans le système nerveux central , y compris l'hypothalamus 1. Un mécanisme potentiel dans lequel cela se produit pourrait être par nanoparticule induite par l' activation de la microglie (cellules immunitaires du cerveau) 4. Des études antérieures ont utilisé des modèles in vivo pour étudier les effets des IP sur la santé du cerveau qui sont de temps, coûteux, et ne répond pas directement à la question de la façon dont les IP influencent la microglie. Les microglies jouent un rôle multiple dans le système nerveux central, y compris la maintenance du microenvironnement du cerveau et de communiquer avec entourant les neurones via la libération de facteurs sécrétés et cytokines. En fonction des stimuli microglie peut être activé pour une pr M1o-inflammatoire ou un état anti-inflammatoire M2. Par exemple, M1 activé microglie libèrent des cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), alors que la microglie activée M2 libèrent des cytokines anti-inflammatoires, y compris l'interleukine-4 (IL-4). Pour valider notre substitut tr biocapteur vitro pour déterminer la neurotoxicité des polluants atmosphériques, nous avons mesuré la réponse microgliale 20 nanoparticules d' argent nm (de AGNPS). Le but de cet article est de décrire comment une lignée de cellules microgliales in vitro peut être utilisé comme un marqueur de biocapteur de substitution pour tester la réponse microgliale murine aux IP et comment la microglie activation affecte les cellules hypothalamiques. Le long terme destiné application de ce modèle validé est de tester les effets des polluants du monde réel sur la santé du cerveau et les maladies neurodégénératives. Nous fournissons une description détaillée d'un in vitro essai de 96 puits de format pour mesurer l' activation de la microglie et la survie des cellules hypothalamique suite à l'exposition des micro roglial milieu conditionné.
activation microgliale a été déterminée après une exposition AGNP utilisant une enzyme TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Pour déterminer l'effet de la microglie activée sur les cellules hypothalamiques, les AGNPS ont été retirés du surnageant microgliales (milieu conditionné) en utilisant un dispositif de filtration. Le dispositif de filtration retient les cytokines tout en excluant les AGNPS en fonction de leur taille. En bref, le surnageant de cellules microgliales traitées avec ou sans AGNPS a été recueilli, ajouté aux filtres et centrifugée à 14 000 xg pendant 15 min. Nous étions alors en mesure de déterminer l'influence de cytokines sécrétées microgliales sur la viabilité des cellules hypothalamique. Toxicité cellulaire après une exposition à des milieux conditionnés (contenant des cytokines) a été déterminée par un dosage à base de résazurine, comme décrit précédemment 5,6. Cellules métaboliquement actives réduisent résazurine et de produire un signal fluorescent proportionnel au nombre de cellules viables 7.
nt "> Il y a plusieurs avantages de l' utilisation de cette technique par rapport à d' autres (comme co-culture, les configurations trans puits, ou dans des expériences in vivo). Notre modèle offre la possibilité d'activer directement les microglies et de déterminer si les facteurs sécrétés sont toxiques pour les neurones 8 . Le protocole actuel utilise immortalisé microglie de BV2 stimulée avec des nanoparticules de 20 nm de diamètre, et cellules immortalisées hypothalamiques murins (désigné mHypo-A1 / 2) 9 pour la détermination de la réponse ultérieure. Bien que ce protocole a été optimisé pour ces conditions spécifiques, les méthodes peuvent être modifiées pour être utilisées dans d'autres modèles de la mort cellulaire induite par la microglie, ou avec d'autres types de cellules, y compris les microglies et les neurones primaires.Protocol
Representative Results
Discussion
Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Materials
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
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