Préparation et<em> In Vivo</em> L'utilisation d'une sonde basée sur les activités pour<em> N</em> -acylethanolamine Amidase Acid

Communément utilisé des méthodes pour étudier les profils d'expression, les interactions et les fonctions des protéines, y compris liquides plates – formes de spectrométrie de chromatographie de masse pour l' analyse de fusil de chasse ^1,2, la levure méthodes deux hybrides ^3,4, et des essais in vitro, sont limités en ce qu'ils sont incapable d'évaluer l'activité des protéines dans leur état natif. par activité protéine profilage (ABPP) peut être utilisé pour combler cette lacune. Dans cette approche, des petites molécules sondes capables de se lier de manière covalente au site actif d'une enzyme d'intérêt sont conjugués à un groupe reporter qui permet la détection de la cible. Utilisation de chimie clic (CC), le journaliste peut être intégré dans la sonde ou peut être introduit après l' engagement de la cible est survenue ^5,6. Cette dernière procédure nécessite l'utilisation de sondes contenant des groupes chimiques appropriés, tel qu'un alcyne ou azoture terminal, qui peut être modifié avec un certain nombre de réactifs de rapporteur par des réactions bio-orthogonale SUCh comme le Cu (I) catalysées Huisgen [3 + 2] ou une cycloaddition ^7-9 Staudinger ligation ^10,11.

Récemment, nous avons dévoilé le ARN14686 composé comme le premier ABP pour la in vitro et in vivo de détection de l'hydrolase de cystéine, NAAA ^12. NAAA catalyse la désactivation hydrolytique d'acides gras saturés et mono – insaturés, y compris FAE oléoyléthanolamide (BAE) et palmitoyléthanolamide (PEA), qui sont des agonistes endogènes du récepteur nucléaire PPAR-alpha anti-inflammatoire ^13-15. NAAA est principalement exprimé dans les macrophages et d' autres cellules dérivées de monocytes, ainsi que dans les lymphocytes B ^14,16, ce qui suggère un rôle dans la régulation de la réponse immunitaire innée. L'enzyme est synthétisée dans le réticulum endoplasmique rugueux sous une forme inactive et est activé dans les compartiments acides de la cellule par un mécanisme autoprotéolytique ^17. Le clivage autoprotéolytique génère une nouvelle cystéine -terminale N (C131 chez la souris et le rat, chez l' homme C126), qui est le nucléophile chargé de l' hydrolyse EAF ^18,19. L' inhibition pharmacologique de l' activité NAAA modifie l'équilibre de synthèse / dégradation EAF en faveur des niveaux cellulaires accrus du FAES ^16,20,21. Plusieurs dérivés de β-lactone et de β-lactame a été démontré que pour inhiber l' activité NAAA avec une puissance élevée et une sélectivité ^16,22-26. Ces inhibiteurs agissent par S acylation de la cystéine catalytique ^16,27,28.

ARN14686 le composé a été conçu sur la base de la structure chimique de l'inhibiteur à action systémique, de la sérine dérivé β-lactame NAAA, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N – [(S) -2-oxoazétidin-3-yl] carbamate) ^16. Le groupe 4-butyl-cyclohexyle de ARN726 a été remplacé par une chaîne aliphatique C9 saturé portant une étiquette alcyne terminal pour CC ultérieure conjugaison avec un journaliste de tag azoture de palier. Nous avons choisi de concevoir un ABP en deux étapes pour Minimally modifier la structure de l'échafaudage d'origine, conservant ainsi l'affinité de la sonde pour NAAA. De plus, en évitant l'introduction d'étiquettes volumineux, une telle sonde pourrait être plus approprié pour le traitement in vivo d'une ABP directe. ARN14686 inhibe NAAA avec une puissance élevée (hNAAA _CI50 = 6 nM, rNAAA _IC50 = 13 nM) en formant un adduit covalent avec la cysteine catalytique de l'enzyme ^12. Des expériences sur des rats vivants ont montré que la sonde est sélective dans la capture NAAA exprimé dans les poumons. Céramidase acide, une autre cystéine amidase qui partage une identité de 33-34% avec NAAA, a également été identifiée comme étant une cible de faible affinité pour l'utilisation de concentrations élevées de sonde (10 uM in vitro, 10 mg / ml par voie intraveineuse, iv) ^12. Nous avons également utilisé ARN14686 pour étudier la présence de NAAA actif dans les tissus de rats enflammées après l' administration de l'adjuvant complet de Freund (CFA) ^29.

Ici, nous décrivons un protocole pour les preparatisur des ARN14686 (Figure 1) et son application à l'enquête de NAAA activation ex vivo. A titre d'exemple, nous décrivons une procédure expérimentale pour visualiser NAAA dans les pattes de rat après administration CFA. Dans cette expérience, les protéines sont extraites à partir du tissu de la patte après l'injection intraveineuse de la sonde, et le protéome PBA marqué est soumis à CC avec de la biotine-azide. échantillons biotinylés sont enrichis en utilisant des billes de streptavidine, et empreintes de protéines sont effectuées. Dans une autre application, on décrit la localisation de NAAA actif par microscopie de fluorescence dans les poumons de souris provenant de souris traitées à la sonde. Dans ce cas, le tissu est sectionné et sections sont soumis à CC pour l'addition de rhodamine. Un système de workflow est illustré à la figure 2.