Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Zellen enthalten eine Vielzahl von Biomakromolekülen, die ständig miteinander in Wechselwirkung treten. Diese Vereinigung führt zu Komplexen, die in den zellulären Wege, die für ihre Funktion in der Signaltransduktion, die Regulation der Genexpression und der Zellmigration unter anderem teilnehmen. Alle Protein-Protein-Wechselwirkungen, die in einer Zelle auftreten, umfassen ein Netzwerk wie das Interaktom bekannt. In Saccharomyces cerevisiae mehr als 70% ihrer Proteine wurden Interaktionspartner ¹ gezeigt zu haben. Das Verständnis der Interaktom einer Zelle und deren Funktionen liefern relevante Informationen über die Komplexität und Vielfalt der Lebewesen. Verschiedene Methoden wurden Protein-Protein-Interaktionen beschrieben zu identifizieren und zu charakterisieren. Verschiedene Hochdurchsatzverfahren, wie Hefe – Zwei-Hybrid – ² – Protein-Fragment Komplementierung Assays ^3, Affinitätsreinigung ⁴ gekoppelt mit der Massenspektrometrie und Protein microarrays verwendet ^5,6 eine Interaktion zu identifizieren. Einmal identifiziert, ist es notwendig, sie zu überprüfen und diese auf einer Fall-zu-Fall-Basis variieren. Typischerweise umfassen diese Versuche die Wechselwirkung selbst auf der Ebene der einzelnen Mitglieder des Wechselwirkungspaares zu stören, beispielsweise durch Gendeletion oder Überexpression eines der Proteine, und dann auf Änderungen in den Eigenschaften oder der Funktion des anderen Elements bei der Suche zellulärer Ebene. Anschließend werden biophysikalische Techniken ⁷ verwendet , um die Protein-Protein – Wechselwirkung auf molekularer Ebene zu charakterisieren. Zu diesem Zweck sind die Struktur von Protein-Komplexe, die durch Röntgenkristallographie bestimmt, kernmagnetische Resonanz und Kryo-Elektronenmikroskopie während Kalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie verwendet werden, um quantitativ und sie mechanistisch beschreiben.

In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzanisotropie als eine Technik verwendet, um die Wechselwirkung zwischen dem GTPase EFL1 und der SBD zu charakterisierenS-Protein. Diese Proteine beteiligen sich an der Synthese von Ribosomen durch die Freisetzung von eukaryotischen Initiationsfaktor Förderung 6 von der Oberfläche der 60S ribosomalen Untereinheit ^8. Das SBDS Protein wird in einer Krankheit als Shwachman-Diamond – Syndrom ⁹ und wirkt als ein Guaninnukleotid – Austauschfaktor für EFL1 abnehm seine Affinität für Guanosindiphosphat ^10,11 bekannt mutiert. Krankheit Mutationen in SBDS die Interaktion mit EFL1 abzuschaffen und somit ihre Aktivierung verhindern.

Fluoreszenzanisotropie wird in biologischen Anwendungen zu untersuchen Protein-Peptid- oder Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen verwendet. Sie basiert auf dem Prinzip, dass ein Fluorophor mit polarisiertem Licht führt zu einer teilweise polarisierte Emission angeregt. Fluoreszenzanisotropie wird durch Gleichung 1 definiert:

wo ich _VV und ich _VH sind dieFluoreszenzintensitäten des vertikal _(VV) und horizontal _(VH) polarisierte Emission , wenn die Probe angeregt wird , mit vertikal polarisiertem Licht ^12. Fluoreszenzanisotropie ist empfindlich gegenüber Faktoren, die die Geschwindigkeit der Rotationsdiffusion des Fluorophors beeinflussen und somit abhängig von der Temperatur, der Viskosität der Lösung und die scheinbare Molekülgröße des Fluorophors. Die scheinbare Grße eines Proteins ein Fluorophor enthält, erhöht, wenn es mit einem anderen Protein und eine solche Änderung in Wechselwirkung kann dann als eine Änderung der Anisotropie ausgewertet werden. Genauer gesagt, der Wert und kleiner I _VH Wert mit einem großen I _VV und daher eine relativ große Anisotropie wird zeigen müssen ein Fluorophor, die sich langsam in Lösung relativ zu seiner Fluoreszenzlebensdauer dreht. Für Fluorophore, die sich schnell in Bezug auf ihre Fluoreszenzlebensdauer im Trockner, ich _VV und ich _VH wird wird ähnlich und ihre Anisotropie sein klein sein ¹² </sup> (Abbildung 1). Darüber hinaus ist für eine gute Anisotropie Signal-Rausch-Messung ist es notwendig, ein Fluorophor mit einer Fluoreszenzlebensdauer ähnlich der Rotationskorrelationszeit des Moleküls von Interesse zu haben. Andernfalls ist es nicht möglich, genau den Unterschied in der Anisotropie zwischen dem freien Protein aufnehmen, und dass in der Anlage. Zum Beispiel kann die Anisotropie einer fluoreszierenden Sonde mit einer Lebensdauer der Nähe von 4 nsec, wie beispielsweise Fluorescein oder Rhodamin zu einer niedermolekularen Verbindung gebunden von 100 Da beträgt 0,05. Die Bindung an ein Molekül von 160 kDa seine Anisotropiewertes auf 0,29 zu erhöhen; ein Unterschied, der genau gemessen werden kann. Im Gegensatz dazu ging es um die gleiche Fluoreszenzsonde in einer Bindungsreaktion, deren Anstieg in Molekülgröße variiert von 65 bis 1.000 kDa führt nur in einer Anisotropie Änderung von 0,28 bis 0,3 ist, die zu klein ist, genau gemessen werden. In diesem Szenario wäre eine Sonde mit einer Lebensdauer von 400 ns mehr geeignet ^12.

Fluoreszenzanwendungen erfordern das Vorhandensein eines Fluorophors in einem der untersuchten Moleküle. Zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen gibt es drei Arten von Fluorophore: 1) die Tryptophan-Reste in den Proteinen, 2) chemisch gebunden Fluorophore und 3) fluoreszierende Fusionspartner wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) und dessen derivativen. Die meisten Proteine ​​haben Tryptophanreste auf seine Struktur und damit die einfachste Weg, um eine Interaktion zu messen, ist durch die Änderungen in dem entsprechenden Fluoreszenzspektren Überwachung oder durch Veränderungen in der Fluoreszenzintensität der Tryptophanreste zu überwachen. Jedoch können Tryptophanreste in beiden Proteinen vorhanden sein, die Analyse erschwert wird. Auf der anderen Seite, für ein Fluorophor aufgrund einer Wechselwirkung muss seine fluoreszierenden Eigenschaften ändern sie auf oder in der Nähe der Bindungsstelle lokalisiert werden und es könnte mit der Interaktion selbst stören. Dies erfordert besondere Aufmerksamkeit, wenn sperrige Fluorophore wie GFP verwenden. Wenn keine dieser Fluorophore können für Bindungsstudien verwendet werden, ist es notwendig, dann, um extrinsische Fluorophore an die eine der beteiligten Proteine ​​einzuführen. Viele chemisch synthetisierte Fluorophore existieren und können kovalent an Proteine ​​über ihre reaktiven Gruppen, wie den Amingruppen (Seitenkette von Lysinen oder N-Terminus) und die Thiolgruppen in Cystein gebunden sein. Fluorophore Derivate mit Isothiocyanat und Succinimidylester reagieren mit Amidgruppen während iodoacetamide und Maleimid sind thiolreaktives Gruppen ^13. Die am häufigsten verwendeten Farbstoffe in Fluoreszenzanwendungen verwendet werden, sind Derivate des Fluorescein und Rhodamin grüne Farbstoffe, Cumarine, BODIPY Fluorophore und Alexa Fluor Farbstoffe. Eine detaillierte Liste der im Handel erhältlichen Fluorophore und ihre Verwendung finden Sie in Referenzen ^14,15 gefunden werden. Für eine erfolgreiche Markierung muss die reaktive Gruppe auf der Oberfläche des Proteins exponiert werden, aber aufgrund der großen Anzahl von reaktiven funktionellen Gruppen typischerweise in Polypeptiden ist es sehr schwer ortsspezifische Modifikation zu erhalten. Das Protein von Interesse in dieser Studie SBDS, enthält 5 freie Cysteine ​​und 33 Lysine, die in mehreren Standorten Kennzeichnung führen kann. Uneinheitliche Kennzeichnung kann die Bindung beeinflussen und Datenanalyse komplizieren als unterschiedliche Fluorophormoleküle unterschiedlichen Fluoreszenzintensitätssignale bei der Bindung auslösen kann. ÖVErcome dieses Problem haben wir den FlAsH Fluorophore, 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein orts direkt das SBDS Protein-Label. Dies ist ein arsenoxide Farbstoff mit einer hohen Affinität für vier beabstandete Cysteine in einem Motiv kennen als Flash-tag der Sequenz CCXXCC aus wobei X für jede Aminosäure außer Cystein ist ^16,17. Dieses Motiv wird Tetracysteinmotiv gentechnologisch zusammen mit einem geeigneten Linker an den N- oder C-Terminus des Proteins hinzugefügt, um die Störung des Gesamtfaltung des Proteins zu verhindern. Das Paar , das aus FlAsH Farbstoff und FlAsH-Tag wurde ursprünglich auf ortsspezifische Label Proteine entwickelt in lebenden Zellen ¹⁷ , sondern es kann auch gereinigte Proteine verwendet werden , in vitro zu beschriften , wie sie hier veranschaulicht wird. Zusätzlich haben enzymatische Strategien auch ¹⁸ ortsspezifische Funktionalisierung von Proteinen zu ermöglichen , entwickelt worden.

In diesem Manuskript beschreiben wir die Nützlichkeit von Fluoreszenzanisotropiemessungen einsa Werkzeug Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Bindung kann durch einfache Inspektion der Bindungskurvenform bewertet werden, während quantitative Informationen können aus der Anpassung der experimentellen Daten erhalten werden.