Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Le cellule contengono una moltitudine di biomacromolecole che interagiscono costantemente con l'altro. Questa associazione dà luogo a complessi che partecipano alle vie cellulari responsabili per il loro funzionamento nella trasduzione del segnale, regolazione dell'espressione genica e la migrazione delle cellule, tra gli altri. Tutte le interazioni proteina-proteina che si verificano in una cella comprendono una rete nota come dell'interattoma. In Saccharomyces cerevisiae hanno dimostrato più del 70% delle proteine di avere partner interagenti ^1. Comprendere la interattoma di una cella e le loro funzioni di fornire informazioni pertinenti sulla complessità e la diversità degli organismi viventi. Diverse metodologie sono state descritte per identificare e caratterizzare le interazioni proteina-proteina. Diverso alto attraverso metodi messi come il lievito doppio ibrido ^2, saggi di complementazione proteine frammento ^3, affinità di purificazione ⁴ accoppiata alla spettrometria di massa e microarra proteineys vengono utilizzati per identificare una interazione ^5,6. Una volta identificato, è necessario convalidare e puo variare caso per caso. Tipicamente, questi esperimenti comportano interrompere stessa interazione a livello dei singoli membri della coppia interazione, ad esempio, dalla delezione gene o sovraespressione di una delle proteine, e quindi cerca di cambiamenti nelle proprietà o funzione di un altro membro del livello cellulare. Successivamente, tecniche biofisiche ⁷ sono utilizzati per caratterizzare l'interazione proteina-proteina a livello molecolare. A tal fine, la struttura di complessi proteici sono determinati mediante cristallografia a raggi X, risonanza magnetica nucleare e la microscopia crioelettronica mentre calorimetria e spettroscopia di fluorescenza sono utilizzati per descriverli quantitativamente e meccanicamente.

In questo lavoro, anisotropia di fluorescenza è stato utilizzato come tecnica per caratterizzare l'interazione tra la GTPasi EFL1 e SBDS proteine. Queste proteine partecipano nella sintesi dei ribosomi promuovendo il rilascio di fattore di inizio eucariotico 6 dalla superficie 60S ribosomiale subunità ^8. La proteina SBDS è mutato in una malattia nota come Shwachman-Diamond Sindrome ⁹ e agisce come un fattore di scambio guanina nucleotide per EFL1 diminuendo la sua affinità per guanosindifosfato ^10,11. mutazioni malattia in SBDS abolire l'interazione con EFL1 e quindi impediscono la sua attivazione.

Fluorescenza anisotropia è comunemente usato in applicazioni biologiche per studiare la proteina-peptide o interazioni degli acidi nucleici proteine. Si basa sul principio che un fluoroforo eccitato con risultati luce polarizzata in una emissione parzialmente polarizzata. Anisotropia di fluorescenza è definito dall'equazione 1:

dove ho _vv e mi _VH sono ilintensità di fluorescenza della verticale _(VV) e in orizzontale _(VH) polarizzati emissione quando il campione è eccitato con luce polarizzata verticalmente ^12. Anisotropia di fluorescenza è sensibile a fattori che influenzano la velocità di diffusione rotazionale del fluoroforo e dipende dalla temperatura, la viscosità della soluzione e la dimensione molecolare apparente del fluoroforo così. La dimensione apparente di una proteina contenente un fluoroforo aumenta quando interagisce con un'altra proteina e tale modifica può essere valutato come un cambiamento di anisotropia. Più specificamente, un fluoroforo che ruota lentamente in soluzione rispetto alla sua durata fluorescente avrà un valore I _VV e piccolo valore I _VH e pertanto presentano una relativamente grande anisotropia. Per fluorofori che scendono rapidamente rispetto al loro ciclo di vita fluorescente, ho _Vv e _VH saranno simili e il loro valore anisotropia sarà piccolo ¹² </sup> (Figura 1). Inoltre, per un buon segnale anisotropia di misura del rumore, è necessario avere un fluoroforo con una vita di fluorescenza simile al tempo di correlazione rotazionale della molecola di interesse. Altrimenti, non è possibile registrare accuratamente la differenza di anisotropia tra la proteina libero e che nel complesso. Ad esempio, l'anisotropia di una sonda fluorescente con una durata quasi 4 nsec come fluoresceina o rodamina collegati a un composto a basso peso molecolare di 100 Da è 0.05. Associazione a una molecola di 160 kDa aumenterà il suo valore anisotropia a 0,29; una differenza che può essere misurata con precisione. Al contrario, la stessa sonda fluorescente coinvolto in una reazione di legame cui incremento di peso molecolare varia da 65 a 1000 kDa comporterà solo un cambiamento anisotropia di 0,28 e 0,3, che è troppo piccola per essere misurata con precisione. In questo scenario, una sonda con una durata di 400 nanosecondi sarebbe più adatto ^12.

applicazioni fluorescenza richiedono la presenza di un fluoroforo in una qualsiasi delle molecole studiate. Per studiare le interazioni proteina-proteina ci sono tre tipi di fluorofori: 1) i residui di triptofano presenti nelle proteine, 2) fluorofori allegate chimicamente e 3) partner di fusione fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP) e la sua Derivative. La maggior parte delle proteine ​​hanno residui di triptofano sulla sua struttura, così il modo più semplice per misurare un'interazione è monitorando i cambiamenti nel corrispondente spettri di fluorescenza o monitorando i cambiamenti nell'intensità di fluorescenza dei residui di triptofano. Tuttavia, residui di triptofano possono essere presenti in entrambe le proteine ​​complicare l'analisi. D'altra parte, per un fluoroforo per modificare le proprietà fluorescenti dovuto all'interazione deve essere situato sopra o vicino al sito di legame e potrebbe interferire con l'interazione stessa. Questo richiede particolare attenzione quando si utilizza fluorofori ingombranti come GFP. Se nessuno di questi fluorofori può essere utilizzato per studi di legame è necessario, quindi, di introdurre fluorofori estrinseci a una delle proteine ​​coinvolte. Molti fluorofori sintetizzati chimicamente esistono e possono essere covalentemente attaccati alle proteine ​​attraverso i loro gruppi reattivi come i gruppi amminici (catena laterale di lisine o N-terminale) ei gruppi tiolici in cisteina. Fderivati luorophore con isotiocianato e succinimidyl esteri reagiscono con gruppi ammidici mentre Iodoacetamide e maleimmide sono gruppi tiolo-reattivi ^13. I coloranti più comuni utilizzati in applicazioni in fluorescenza sono derivati ​​del fluoresceina ei coloranti verdi rodamina, cumarine, fluorofori BODIPY e coloranti Alexa Fluor. Un elenco dettagliato dei fluorofori disponibili in commercio e il loro uso può essere trovato in riferimenti ^14,15. Per l'etichettatura di successo, il gruppo reattivo deve essere esposto sulla superficie della proteina, ma a causa del gran numero di gruppi funzionali reattivi tipicamente presenti in polipeptidi è molto difficile ottenere modificazioni sito-specifica. La proteina di interesse in questo studio, SBDS, contiene 5 cisteine ​​libere e 33 lisine che possono provocare l'etichettatura più siti. l'etichettatura non uniforme può influenzare il legame e complicherà l'analisi dei dati come diverse molecole fluorofori possono suscitare diversi segnali di intensità fluorescente su vincolante. a Overcome questo problema, abbiamo usato il fluoroforo flash, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina all'etichetta sito-diretta la proteina SBDS. Questo è un colorante arsenoxide con alta affinità per quattro cisteine distanziati in un motivo conosciuto come FlAsH-tag costituito dalla CCXXCC sequenza in cui X è un qualsiasi amminoacido diverso cisteina ^16,17. Questo motivo tetracysteine ​​viene aggiunto N- o C-terminale della proteina mediante ingegneria genetica insieme ad un linker opportuno evitare l'interruzione della piega complessiva della proteina. La coppia che consiste di Flash tintura e Flash-tag è stato originariamente progettato per le proteine di etichette site-specific nelle cellule viventi ^17, ma può anche essere usato per etichettare le proteine purificate in vitro come è esemplificato qui. Inoltre, sono stati sviluppati strategie enzimatici per consentire funzionalizzazione site-specific di proteine ^18.

In questo manoscritto descriviamo l'utilità di anisotropia di fluorescenza unTool SA per studiare le interazioni proteina-proteina. Binding può essere valutata semplice ispezione della forma vincolante curva mentre le informazioni quantitative può essere ottenuta dalla misura dei dati sperimentali.