التنميط الجيني ل<em> المكورات العنقودية الذهبية</em> من جانب خاص بالريبوسوم فاصل PCR (RS-PCR)
Özet
Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.
Abstract
The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.
Introduction
المكورات العنقودية (S. المذهبة) كما هو معروف الممرض أهم المسؤولين في جميع أنحاء العالم للعدوى داخل الثدي (IMI) في الماشية 1. الدراسة التي فورنييه وآخرون. 2 موضح في الأبقار السويسرية والدراسات التي Cosandey وآخرون. (3) وبوس وآخرون. 4 في الأبقار من 12 دولة أوروبية أن س. العنقودية الذهبية المعزولة من الأبقار IMI هي مجموعة غير متجانسة وراثيا. بواسطة PCR التضخيم من 16S-23S الريباسي المنطقة فاصل بين الجينات (RS-PCR)، تم الكشف عن ما مجموعه 17 المورثات في البداية في 101 العزلات مستقلة وبائيا 2. كان النمط الجيني B و C التركيب الوراثي (GTC) الأكثر شيوعا (80٪)، في حين أن الأخرى 15 المورثات (GTS) وقعت نادرا، مما يجعل كل 1-4٪ من العزلات. على المستوى الأوروبي 3، GTB، GTC، GTF، كان GTI، وGTR التراكيب الوراثية أهم تضم 76٪ من جميع سلالات تحليلها (ن = 456). كانت تقع GTB في وسط أوروبا ثhereas وزعت على نطاق واسع في المورثات الأخرى. شملت 24٪ المتبقية من سلالات 41 المورثات، وكثير منهم، ومع ذلك، لوحظت مرة واحدة فقط.
أثبتت الدراسات التي فورنييه وآخرون. 2، Cosandey وآخرون. 3، وجرابر وآخرون. 5 أيضا أن المورثات كانت مرتبطة إلى حد كبير مع نمط الفوعة الجينات الخاصة بهم، وكذلك في سويسرا بصفتها ممثلة على المستوى الأوروبي. كشف مزيد من الدراسات اختلافات كبيرة في انتشار IMI بين س. أصيب النظر GTB، تصل إلى 87٪ من الأبقار في قطيع من هذا النمط الجيني: الذهبية GTB، GTC والمورثات الأخرى 2،5. في حالة GTC ومن المورثات الأخرى، ومع ذلك، IMI تم العثور فقط في 1-2 الأبقار من قطيع.
IMI التي تسببها س. الذهبية، يؤدي عادة إلى التهاب في الغدد الثديية المقابلة وبزيادة الخلايا الالتهابية في الحليب. ونتيجة لذلك، وشارك الخلايا الجسديةUNTS في الحليب (SCC)، المؤشر الرئيسي للجودة الحليب في معظم البلدان، وتزداد مما أدى إلى سعر الحليب انخفضت أو حتى توقف التسليم.
إلى جانب RS-PCR من فورنييه وآخرون. 2، وقد وصفت أساليب الكتابة الأخرى لعملية التصنيف الفرعي لسلالات الأبقار من S. الذهبية 8-11. تشمل اثنين من تلك الشائعة في الكتابة سبا 12 و متعدد الحالة رقم تسلسل الكتابة (MLST) 13. ويستند السابق واحد على تسلسل الحمض النووي في المنطقة هل المتغيرة من الجين الترميز سبا العنقودية للبروتين A، في حين أن واحدة الأخير يتطلب تسلسل 7 جينات التدبير المنزلي. هذا يعني أن واحدا 12 وسبعة تقارير إنجاز المشروعات 13، على التوالي، في حاجة إلى أن يقوم، تليها تنقية amplicon، رد فعل التسلسل والتحليل باستخدام معدات معينة. مقارنة RS-PCR، وهذه الأساليب تتطلب جهدا إضافيا كبيرا في المختبر مما أدى إلى سرعة عينة انخفاض وارتفاع التكاليف. الإنتاجية منخفضة بشكل خاص لPFGE. وبالنظر إلى قرار من هذه الأساليب لسلالات الأبقار من S. الذهبية، RS-PCR على الأقل جيدة كما سبا كتابة 4 وأفضل من MLST 4 أو PFGE 15.
أظهرت جميع هذه الطرق بما في ذلك الكتابة الثنائية 13 فعاليتها في الحصول على مزيد من التبصر في التسبب في الأبقار IMI التي تسببها س. الذهبية، ولكن بسبب القيود المذكورة هم أقل ملاءمة للتحقيقات سريرية واسعة النطاق. وبالإضافة إلى ذلك، التنميط الجيني عن طريق RS-PCR كما وصفها فورنييه وآخرون. 2 يسمح للتنبؤ موثوق لالوبائية واحتمال المسببة للأمراض من س. الذهبية تشارك في الأبقار IMI، قيمتين الرئيسية في الطب البيطري السريري.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الأكثر أهمية الإجراء كله هو عندما يكون هناك فائض من الحمض النووي في RS-PCR (> 30 نانوغرام النقي DNA / الفحص) 2. بشكل عام، قرار من هذا التوصيف الأمثل إذا كان كل من مستويات الذروة التي بلغتها تبدأ وتنتهي عند خط الأساس. إذا قمتين متقاربة جدا، والقرار هو غير مكتمل. ف?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.
Materials
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw =121.14g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5mol/l | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
Referanslar
- Sears, P. M., McCarthy, K. K. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).
- Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
- Cosandey, A., et al. Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries. J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).
- Boss, R., et al. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer. J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).
- Graber, H. U., et al. Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties. J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).
- Heiniger, D., et al. Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben. Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).
- Hamann, J. Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition. IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).
- Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).
- Sakwinska, O., et al. Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley. Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).
- Rabello, R. F., et al. Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds. J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).
- Tavakol, M., et al. Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands. Acta Vet.Scand. 54, 28 (2012).
- Harmsen, D., et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).
- Zadoks, R., et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).
- Cremonesi, P., et al. Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows. J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).
- Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).
