We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.
Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.
접는 및 세포 내 환경에서 작동 할 수있는 항체는 연구 및 치료 응용 프로그램 모두를위한 유망한 도구입니다. 이들은 단백질 – 단백질 상호 작용을 방지 단백질 – 핵산 상호 작용을 방해하거나 효소 1-5 기판 액세스를 방지하기 위해 셀 내부의 표적 단백질에 결합하여 단백질의 활성을 조절하는 능력을 갖는다.
항체가 세포 내 애플리케이션 많은 잠재력을 가지고 있지만, 표적 항원에 결합하는 능력을 유지하면서 세포 내 환경의 적절한 폴딩 및 용해성을 설계하는 것은 어려운 것이다. 환원 세포질 환경은 일반적으로 전장 항체의 단일 사슬 가변 단편 (scFv를) -6,7- 항체를 포함한 항체 단편의 폴딩 안정에 필요한 이황화 결합의 형성을 방지한다. 지향 진화 접근 방법은 시간과 함께 항체를 엔지니어에게 이용되어왔다대상에 대한 고등학교의 친화력은 8-10 항원. 이러한 접근은 일반적으로 11-13 항체의 대규모 라이브러리를 선별, 파지 디스플레이, 효모 표면 디스플레이, 박테리아 표면 디스플레이를 사용한다. 이러한 방법은 대상에 결합하는 항체를 식별하기위한 강력하고 효과적이다, 그러나 그들은 14 ~ 16을 표시됩니다 단백질을 수송하기 위해 분비 경로에 따라 달라집니다. 분비 경로는 효모 나 박테리아의 페리 플라 즘에 소포체 내강으로 감소 세포질에서 펼쳐진 단백질으로 전위. 단백질은 산화 조건 하에서 접어 세포 표면 상에 표시하거나 친화 17,18 래핑 선별 파지 입자로 패키징된다. 그 결과, 이들 기술을 이용하여 분리 된 항체는 반드시 세포질에서 잘 접하지 않으며, 항체는 세포 내 용도로 사용할 경우, 세포 내 용해도는 종종 개별적으로 설계되어야한다.
개선하기또한 세포질에 접어 공학 항체의 효율성, 우리는 이전 MAD-TRAP (연관 단백질 타트 기반 인식 막 – 고정 디스플레이)의 성공 대장균 inner- 사용 된 scFv 항체 라이브러리를 스크리닝하기위한 방법을보고 막 디스플레이 19. 세균 내 멤브레인 디스플레이 분비 경로를 사용하는 다른 공통의 표시 방법과 대조적으로, 표시된 항체 수송 트윈 아르기닌 전좌 (TAT) 경로에 의존한다. 타트 경로는 수용성 정확하게 접힌 단백질은 E.에서 이송 될 수 있도록하는 품질 제어 메커니즘을 포함 막을 가로 지르는 내측 및 주변 세포질 (20, 21)에 대장균의 세포질. 잘 세포질에 접어합니다 (문신 신호 펩타이드 ssTorA에 N- 말단 융합과 문신 경로를 대상으로 예. 단백질)가 과발현 문신 기판은 N 말단에 중간 긴 수명 전위를 형성 전세포질 및 주변 세포질 (19)의 C 말단 N. 이는 E.의 세포질 표면에 항체 단편을 포함 올바르게 접혀 타트 기판의 표시를 허용 대장균 내부 막. spheroplasts를 생성 효소 절단에 의해 상기 외부 막을 제거한 후, 항체는 세포 외 공간 (도 1)에 노출된다. 이 내막에 표시 문신 기판이 특정 대상에 대한 결합에 대해 스크리닝 할 수 있습니다. 중요한 것은, 세포 표면 디스플레이를 위해 문신 경로를 활용하는 것은 아니라 세포질에 접어 라이브러리 만 항체 친 화성 세포 폴딩 결합 동시 엔지니어링을 가능 바인딩 심문 될 것임을 보장한다. 이 프로토콜에서, 우리는 E.에서의 scFv 라이브러리를 표시하는 방법에 대해 설명합니다 콜라이 내막은 표적 항원에 대한 라이브러리를 패닝 및 라이브러리의 가장 유망한 성분을 식별하기위한 보조 스크린을 수행한다. 우리는 초점 동안 scFvs의 프로토콜은,이 방법은 그 응용 결합하고 세포 내 접힘이 필요한 단백질을 설계에 적용 할 수있다.
그림 1. 문신 내부 멤브레인 표시됩니다. E.에서 대장균은 ssTorA 신호 서열에 융합으로 표현 올바르게 세포질 접어의 scFv 항체는 내막을 가로 질러 전송된다. scFvs가 세포질에서 N 말단 및 주변 세포질의 C- 말단과 내부 막에 고정되는 전위의 중간 형태. E. 대장균 세포 외막 효소는 이에 외 공간에 고정 된 항체를 노광 및 디스플레이 항체의 C 말단 융합 된 에피토프 태그에 결합하는 항체를 사용하여 검출하기에 사용할 수 있도록 spheroplasts을 형성하도록 분해된다.로드 / 54583 / 54583fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세포질 행위 항체 엔지니어 인해 이황화 결합 -6,7- 안정화의 형성을 방해 세포질의 환원 환경에 어려운 작업이다. 이것은 그들이 결합 친 화성을 위해 설계되는 이외에 세포질에서 안정성 및 용해도를 위해 설계되지 않는 비활성 세포질 대부분 항체를 야기한다. 파지 디스플레이, 박테리아 표면 디스플레이, 효모 표면 디스플레이 방법은 기존의 방법은 모든 설계 항체의 표시 분비 경로 14-16를 사용하지만, 이러한 방법은 세포 내 접힘 엔지니어링 할 수단이 없다. 타트 경로의 폴딩 품질 관리가 잘못 접힌 세포질 불안정 항체의 전위를 방지하기 때문에 내부 멤브레인 디스플레이를 사용하여 조작 된 항체는 세포 내 안정성 및 용해도를 개선했다. 이 방법은 친 화성 A에 대한 엔지니어링 세포 내 항체의 반복적 인 프로세스를 단순화차 용해도, 두 특성이 한 단계로 설계되어있다. 이 방법은 감소 세포 환경에서 용해도와 항체 공학적 설계되었지만, 또한 단백질이 방법은 페리 플라 즘의 산화성 환경에서 폴딩을 유지하여 설계되기 때문에, 비 환원성 조건에서 작동하도록 설계 항체에 적용될 수있다.
이 기술은 높은 친 화성이 높은 세포질 용해도 항체 엔지니어링 프로세스를 간소화 있지만, 몇 가지 제한 사항이 프로토콜을 사용할 때 고려해야 할 중요하다. 보조 화면 ELISA 신호를 분석 할 때의 scFv 변종 약속 확인하려면, 적절한 항원 결합을 전시하지 않을 수 잠재적으로 흥미 변형과 그 사이의 안목에 대한 임계 값은 몇 클론 추가 특징으로 한 때까지 알 수있을 것 같지 않다. 이 모 항체에 걸쳐 개선 된 결합을 찾기 위해 중요하다; 하나,비정상적으로 높은 신호는 결합력 29 또는 응집 효과 (30), 내부 멤브레인 디스플레이 검사 방식에 고유하지 않은 문제를 나타내는 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 패닝 후 spheroplasts를 복구 할 수없는 경우가 아닌 실행 가능한 (게시되지 않은 데이터)만큼 키 제한은 기억한다. 이 항체를 코딩하는 플라스미드를 복구하는 DNA 증폭 및 변환 단계를 필요로한다.
프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 접는과 항체의 결합의 동시 공학을 할 수 있습니다. 심사에 성공하려면, 상영되는의 scFv 라이브러리는 ssTorA 신호 펩타이드 융합으로 표현해야합니다. 이 순서없이, 항체는 문신 경로로 이동하지 않으며, 따라서 페리 플라 즘 (19)에 전좌되지 않습니다. 또한,이 C 말단 에피토프 태그는 bin에 기재된 항체의 검출을 허용하는 항체에 융합하는 것이 필수적이다땡 분석. 분명히, E. 대장균은 또한 필요한 경로 문신 기계가 있어야 scFvs를 표현하는 데 사용하지만, 이는 통상적으로 사용 된 E. 마찬가지다 대장균 균주.
이 프로토콜에 대한 수정이 원하는 특성을 가진 항체를 분리 할 가능성을 향상시킬 수 있습니다. 감산 패닝 단계 전에 원하지 않는 구성 요소의의 scFv 라이브러리를 고갈 표적 항원에 대해 패닝을 완료 할 수있다. 라이브러리 spheroplasts 비 목적 단백질 단독 또는 코팅 BCCP 피복 자성 비드와 함께 배양 할 수 있고, 이러한 비드에 결합하는 spheroplasts 원하는 표적에 대한 결합에 대한 나머지 바운드 spheroplasts 선별 전에 폐기 될 수있다. 대표 결과에 언급 된 바와 같이, 방법은 고립 된 scFv의 친 화성이 spheroplasts에 표시 scFvs과 경쟁 패닝 반응 가용성 선수를 포함하는 개선한다. 가용성 빌려 때문에etitor에는 DNA가 spheroplasts에 표시 scFvs 그렇게 만 서열은 PCR 반응에서 회수되며, 그것에서 증폭되지 않는, 정제 된 단백질이다. 또한,이 방법은 항체 또는 비 – 항체 결합 단백질에 대한 다른 유형의 엔지니어링 확장 될 수있다.
대장균 내부 멤브레인 디스플레이는 높은 친 화성 및 세포 내 용해도가 높은 수준의 엔지니어링 항체를위한 강력한 플랫폼입니다. 이 방법은 세포 내 환경에서 작동하도록 설계 항체의 효율적인 엔지니어링에 특히 적합하다. 이러한 세포 내 항체는 이미 신경 퇴행성 질환, 암 및 바이러스 감염 (31)를 포함하는 필드의 수의 잠재적 치료제로 모색되고있다. 이 기술은 연구와 의학 이러한 필드 및 동일계에서 단백질 표적이 요구된다 공부 다른 필드 도구와 같은 세포 내 항체의보다 광범위한 사용을 가능하게 할 것이다.
The authors have nothing to disclose.
We thank Tomer Zohar for work on scFv screening and characterization assays. A portion of this work was supported by award number F32CA150622 from the National Cancer Institute (to AJK). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Cancer Institute or the National Institutes of Health.
scFv library | Varies | N/A | A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source. |
MC4100 E. coli cells | Coli Genetic Stock Center | 6152 | Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method. |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | BD | 244610 | |
Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M | Fisher Scientific | BP2482-500 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L3790-10X1ML | |
Vortex mixer | VWR | 97043-564 | |
Bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | |
D-Biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755-1 | |
BugBuster Master Mix (cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71456 | |
Vivaspin 2 MWCO, 3000 daltons | GE Healthcare Sciences | 28932240 | |
Target antigen | Varies | N/A | Purified target antigen may be purchased or produced/purified. |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen | 65601 | |
Dynamag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Tube rotator | VWR | 13916-822 | |
PCR primers | IDT | N/A | Primer sequences are as described in the protocol. |
10X T4 DNA ligase reaction buffer | New England BioLabs | B0202S | |
T4 Polynucelotide kinase (PNK) | New England BioLabs | M0201S | Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP. |
5X Phusion HF buffer pack | New England BioLabs | B0518S | |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP | New England BioLabs | N0447L | |
Phusion DNA polymerase | New England BioLabs | M0530S | Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted. |
C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module | Bio-Rad | 185-1148 | |
Agarose | Promega | V3121 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
Wizard SV gel and PCR clean-up system | Promega | A9281 | |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Microdialysis membrane filter | EMD Millipore | VSWP04700 | |
Agar | BD | 214030 | |
96-well polystyrene round-bottom cell culture plates | VWR | 10062-902 | |
Costar general polystyrene assay plate lids | Corning | 3931 | |
Microtitre plate shaker | VWR | 12620-926 | |
Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate | Corning | 3369 | |
Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool | Bel-Art Products | 378760002 | |
Instant nonfat dry milk | Quality Biological | A614-1000 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71092-3 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse | Sigma Aldrich | A8592 | |
SigmaFast OPD | Sigma Aldrich | P9187-50SET | |
Sulfuric acid (H2SO4), 10N solution | Fisher Scientific | SA200-1 | |
Reynolds Wrap aluminum foil | VWR | 89079-075 | |
BioTek Epoch microplate spectrophotometer | Fisher Scientific | 11120570 |