Мы покажем, как подготовить косые срезы спинного мозга у молодых мышей. Этот препарат позволяет для стимуляции брюшных корней.
Электрофизиологические записи из спинного мозга срезов оказались ценным техникой, чтобы исследовать широкий круг вопросов, от сотовой сети к свойствам. Мы покажем, как подготовить жизнеспособные косые срезы спинного мозга молодых мышей (P2 – P11). В этом препарате, мотонейронов сохраняют свои аксоны выходят из вентральных корешков спинного мозга. Стимуляция этих аксонов вызывает обратно распространяющихся потенциалов действия агрессора мотонейроного Somas и захватывающие мотонейроного коллатерали в спинном мозге. Возможность записи Антидромные потенциалов действия является непосредственным, окончательным и элегантный способ охарактеризовать личность мотонейроном, которая превосходит другие методы идентификации. Кроме того, стимулируя мотонейроного коллатерали является простым и надежным способом для возбуждения залога целей мотонейронов в спинном мозге, такие как другие мотонейронов или Renshaw клетки. В этом протоколе, мы представляем антидромным записи с мотонейроного СОСМ, а также клеточного возбуждения Реншоу, в результате чего из вентральных корешков стимуляции.
Исторически сложилось так , мотонейронов записи с помощью острых электрода сравнения были проведены в естественных условиях на крупных животных , таких как кошки или крысы 1 или на изолированном всего спинного мозга у мышей 2. Появление метода записи патч-зажим в течение 1980-х годов, называемый прямой доступ к мотонейроном СОСМ в качестве герметизирующего необходимо достичь под визуальным руководством. Таким образом, спинной мозг препарат срез был легко достигнут с начала 1990 – х годов 3. Тем не менее, в начале подготовки срез часто не позволяли для стимуляции брюшных корней. Насколько нам известно, только два исследования сообщили об успешном стимуляцию брюшных корней в поперечных срезах, и никто не был получен от мышей 4,5.
В этой статье мы представляем технику для достижения жизнеспособных спинного мозга ломтиков неонатального мышей (P2 – P11), в котором мотонейрон бассейн сохраняет свои вентральных корешков отходя аксонов. вентиляционныйКорневой стимуляция RAL вызывает Антидромные потенциал действия обратно в РРОС из мотонейроного бассейна, выходящего из того же корня вентральной. Он также возбуждает цели залога мотонейроном, другие мотонейронов 6-10 и клетки Реншоу 11-13. Так как только мотонейроны послать свои аксоны вниз вентральной корни, мы используем запись Антидромные потенциалов действия в качестве простого и окончательного способа physiologicaly идентифицировать мотонейроны 10.
В дополнение к использованию потенциально не включено или вводящие в заблуждение электрофизиологические и морфологические критерии для подтверждения личности мотонейроном, недавние исследования по мотонейронов спинного мозга также опирался на утомительно и отнимает много времени постфактум 16 окрашивания. Такая идентификация обычно выполняется только на образце записанных клеток. Другие стратегии идентификации полагаются на линии мышей, в которых мотонейроны выражающих эндогенной флуоресценции <sup> 17-19. Тем не менее, с помощью генетически кодируемых маркеров может быть затруднено в молодом возрасте, когда выражение маркера еще переменная или если исследование уже требует использования трансгенной линии мыши. В качестве альтернативы, Антидромная потенциала действия записи может быть выполнена обычно на всех мышей от начала записи клеток. Экспериментаторы , работающие на интактных препаратах спинного мозга у кошки, крысы и мыши, которые надежно используются такие методы идентификации с 1950 – х 1,2,20,21. В оптимальных условиях, мы смогли выявить Антидромные потенциалы действия практически из всех записанных мотонейронов.
Кроме того, вентральной корень стимуляция может быть использована для надежного возбуждения других мотонейронов 22,23 или их цели. клетки Реншоу 10,24,25. Мы представляем здесь приложения вентральной корня стимуляции в виде Антидромная потенциала действия записей из мотонейроного РРОС, а также возбуждение клеток Реншоу.
Косая нарезка спинного мозга имеет важное значение, поскольку она позволяет односторонней стимуляции мотонейронов бассейнов и клеток Реншоу в одном позвоночном сегменте в надежной, всеобъемлющей и определенным образом. Кроме того, она позволяет быстро, элегантной и не двусмысленной …
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Marin Мануэля и Оливия Гольдмана-Szwajkajzer за помощь в принятии фотографии. Авторы также благодарят Arjun Masukar и Tobias Бок за вычитку рукописи. Финансовые опоры были предоставлены Agence Nationale Recherche пур ля (Гипер-БДН, ANR-2010-Blan-1429-01), НИЗ-NINDS (R01NS077863), то Тьерри Latran Foundation (OHEX проекта), французская ассоциация миопатия ( грант номер 16026) и Target ALS Бидани. Феликс Лерой был получателем "Contrat докторских" из Ecole Normale Supérieure, Качан.
Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
KCl | Sigma | P3911 | |
NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
sucrose | Sigma | S9378 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
glucose | Sigma | G5767 | |
ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
K-gluconate | Sigma | P1847 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
NaCl | Sigma | S9888 | |
Agar | Sigma | A9799 | |
QX-314 | Alomone | Q150 | |
Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
CsOH | Sigma | 232041 | |
Na-GTP | Sigma | 51120 | |
gluconic acid | Sigma | G1951 | |
Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
KOH | Sigma | P5958 | |
Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 |