Analisi trascrizionale dal nascente RNA FISH di<em> In Vivo</em> Cellule del trofoblasto giganti o<em> In Vitro</em> Culture a breve termine di Ectoplacental Cono espianti
Özet
Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.
Abstract
La placenta deriva da una stirpe extra-embrionali, il trophectoderm. Nel peri-impianto blastocisti murine, le cellule trophectoderm murali si differenziano in cellule giganti trofoblasto primaria (TGC), mentre il trophectoderm polare sovrastante massa cellulare interna continua a proliferare poi differenziarsi in TGC secondari. TGC svolgono un ruolo chiave nello sviluppo e nella placenta sono essenziali per una gravidanza. Indagine di regolazione trascrizionale di geni specifici durante lo sviluppo post-impianto può dare intuizioni sviluppo TGC. Le cellule del cono ectoplacental (EPC) da embrioni a 7-7,5 giorni di gestazione (E7-7.5), derivato dal trophectoderm polare, si differenziano in TGC secondarie 1. TGC può essere studiato in situ, su sezioni al criostato di embrioni a E7 sebbene il numero di TGC è molto basso in questa fase. Un mezzo alternativo di analisi secondaria TGC è quello di utilizzare le culture a breve termine dei singoli EPC da E7 embrioneS. Si propone una tecnica per analizzare lo stato trascrizionale di geni di interesse sia in vivo che in vitro, a livello di singola cellula mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH RNA) per visualizzare trascritti nascenti. Questa tecnica fornisce una lettura diretta di espressione genica e permette la valutazione dello stato cromosomico di TGC, che sono grandi cellule endoreplicating. In effetti, una caratteristica chiave di differenziazione terminale di TGC è che escono il ciclo cellulare e sottoposti a vari cicli di approccio endoreplication.This possono essere applicati per rilevare l'espressione di un gene espresso da autosomi e / o cromosomi sessuali e può fornire informazioni importanti in sviluppo meccanismi così come le malattie della placenta.
Introduction
Mammiferi trofoblasto cellule giganti (TGC) formano una barriera tra tessuti materni ed embrionali. Essi mediano l'impianto e l'invasione del concepito nell'utero e giocano ruoli critici in sviluppo per la formazione della placenta. Essi producono diversi fattori di crescita (citochine) e ormoni della famiglia e gli steroidi prolattina / placentare Lactogen, necessari per la crescita embrionale e la sopravvivenza. TGC sono grandi, mononucleate e poliploide celle con un ciclo cellulare, la endocycle, che consiste nell'alternare fasi S e G. Infatti, TGC sono endoreplicating cellule, in grado di sottoporsi a vari cicli di sintesi del DNA, senza alcuna divisione 2. Al fine di indagare lo stato trascrizionale dei geni in vivo, in TGC rispetto ad altri tipi di cellule embrionali e fetali, nascente RNA FISH può essere eseguita in vivo su sezioni al criostato 3 a specifiche fasi di post-impianto. TGC sono facilmente riconoscibili sulle sezioni a causa di theiR grandi dimensioni e la loro attività trascrizionale del gene possono essere registrati, ma il loro numero nelle fasi iniziali post-impianto è basso. Scarsità di TGC su E7 sezioni embrionali, ci ha portato a realizzare le culture a breve termine dei tessuti trophectodermal embrionali per ottenere TGC differenziate al fine di studiare la regolazione dell'espressione genica durante lo sviluppo trophectoderm. Inoltre, al fine di rimanere il più fisiologico possibile, linee cellulari stabilizzate cioè trophectoderm cellule staminali (TS) non sempre sono adatti per studiare i meccanismi di sviluppo Generazione di TGC secondarie forniscono un valido strumento per studiare le gravidanze patologiche associate a difetti di certificati verdi negoziabili a causa di gene anomalo regolamentazione nei topi.
Cellule del trofoblasto del cono ectoplacental (EPC) sono precursori di TGC secondarie 4. Differenziazione spontanea di EPC in coltura per TGC secondario è stato riportato in precedenza 5. Tuttavia, a differenza TGC primari, studi su differen TGC secondariaziazione sono rimasti limitati, presumablydue alle difficoltà di isolare espianti EPC, libero da qualsiasi tessuti materni o embrionali. Abbiamo adattato questi metodi, per eseguire RNA FISH su TGC secondarie derivate da embrione a E7, una fase di sviluppo post-impianto dove TGC sono molto pochi ma potrebbero essere generati da precursori EPC. RNA FISH analizzare trascritti primari nucleari è mai stato fatto a livello del livello di singola cellula su TGC secondarie. Questo permette l'analisi precisa di trascrizione ed è stato utilizzato per mostrare l'instabilità epigenetica di TGC nelle fasi post-impianto 3.
Un classico esempio di epigenetica nei mammiferi, l'inattivazione del cromosoma X (XCI) è studiato in laboratorio Heard 6. In questo processo uno dei 2 cromosomi X nella femmina è inattivato. La non-codificante Xist trascritto ricopre il cromosoma X da cui viene espresso in cellule femminili e innesca silenziamento maggior parte dei geni. Utilizzando RNA FISH,trascritti nascenti di geni X-linked possono essere studiati come può l'accumulo di RNA Xist sul cromosoma X inattivo (Xi). Descriviamo qui di una procedura per eseguire l'RNA FISH su sezioni di embrioni post-impianto e sulle culture a breve termine di EPC. Questo protocollo adattato da quelli che sono stati utilizzati per studiare XCI nel differenziare le cellule staminali embrionali femminili ed embrioni preimpianto 7-11. Forniamo esempi di XCI in embrioni di sesso femminile in vivo, così come in vitro TGC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nascente RNA FISH rappresenta un metodo semplice e sensibile per la singola analisi delle cellule di attività trascrizionale in tessuti embrionali a diversi stadi di sviluppo. La potenza di questo approccio è la capacità di individuare diverse linee embrionali in qualsiasi fase particolare secondo i criteri morfologici. Tuttavia, questo richiede anche che sfondo minima fluorescenza è presente. Tale fondo rende l'identificazione delle diverse regioni embrionali e tipi di cellule di sfida. Per garantire sfondo minima, ci sono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo è la qualità del cryosection e il secondo è l'efficienza (rapporto segnale rumore) del RNA FISH, che dipende dal livello di espressione genica e la qualità della sonda. Per questi ultimi, le sonde sono quindi sempre testati su cellule coltivate su vetrini (cellule staminali embrionali o cellule somatiche) prima dell'uso su sezioni.
In questo protocollo, forniamo °tecniche e necessari per eseguire RNA analisi FISH su TGC da due diversi tipi di preparazione del campione (sezioni al criostato e colture primarie di espianti embrionali). Tale analisi singola cella consente cambiamenti dinamici di espressione genica nelle diverse fasi post-impianto da valutare.
I metodi che descriviamo di generare secondaria TGC (a E7-7.5 fasi post-impianto) sono stati utilizzati nel nostro laboratorio per studiare i modelli X-inattivazione del cromosoma di un lignaggio extra-embrionali che è costituito di TGC nelle fasi post-impianto. sviluppo extra-embrionali nei roditori dipende dalla differenziazione dei TGC. Infatti, TGC sono essenziali per lo sviluppo della placenta e quindi embrionale. Difetti di differenziazione TGC causa letalità embrionale (per la revisione vedi riferimento 15). Attività trascrizionale di TGC utilizzando RNA FISH ci ha permesso di dimostrare un cromosoma X stato di inattivazione inusuale di questo tipo di cellule durante lo sviluppo del mouse 3.
<p class = "jove_content"> I metodi presentati qui per ottenere e studiare TGC secondaria può essere applicato per studiare vie molecolari nello sviluppo delle importanti tessuti extraembrionali cui fanno parte, sia in topi normali e mutanti. Questi approcci potrebbero essere adattati per indagare sviluppo TGC in altri mammiferi. La nostra analisi ha coinvolto l'uso di embrioni di topo selvatico tipo che ci permette di valutare l'attività trascrizionale di diversi geni in vivo TGC e in TGC in vitro derivate da EPC espianto. Questo metodo può essere esteso all'analisi di topi transgenici e / o con l'aggiunta di molecole di inibitore nel mezzo di coltura. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo di RNA FISH su un altro tipo di TGC, come ad esempio TGC primarie che appaiono in una fase iniziale di sviluppo del mouse, blastocyts E3.0, che può essere personalizzato in coltura per 4-5 giorni durante i quali hanno sviluppato conseguenza, i ICM di essere circondata da grandi TGC primarie 16,17. trascrizioni nascenti per diversigeni così come Xist potrebbero essere visualizzati e quantificati utilizzando lo stesso approccio RNA FISH 3.Immunofluorescenza combinato e RNA FISH possono essere eseguite anche su sezioni al criostato e in vitro TGC coltivate 3. Ciò dimostra che il metodo è abbastanza robusto, come trascritti primari sono altamente suscettibili di degradazione e vi è un requisito assoluto di composti liberi RNasi. IF / RNA FISH fornisce ulteriori informazioni sui livelli di trascrizione, localizzazione cellulare e l'espressione della proteina, allo stesso tempo in una determinata cella. Anche se, le sezioni di tessuto incluso in paraffina sono stati precedentemente utilizzato per rilevare l'RNA nascente nei tumori umani, pur mantenendo la morfologia del tessuto 18, nelle nostre mani, sezioni al criostato sono più appropriati per preservare l'RNA nascente e gli epitopi necessarie per il rilevamento da parte di anticorpi durante immunofluorescenza .
Oltre a RNA FISH, seguendo immunofluorescence, cromosomico DNA pesce può anche essere eseguita su TGC secondari utilizzando sonde marcate con fluorocromi, simili a quelli utilizzati per l'RNA FISH 3. Sonde fluorescenti possono essere sia plasmidi / fosmidi o BAC, etichettati con dUTPs fluorescenti ed usati qui, e descritti in Chaumeil et al., 8. In alternativa, oligonucleotidi fluorescente possono essere utilizzati 19. Poiché DNA FISH non richiede strand-specificità, sonde oligonucleotidiche possono essere progettati per indirizzare uno dei due filamenti complementari nella regione bersaglio. Sonde di DNA ramificato, in cui l'amplificazione del segnale è ottenuto attraverso due cicli sequenziali di sonde specifiche e amplificazione possono anche essere utilizzati per migliorare il rapporto segnale-rumore dei segnali FISH 20. In alternativa, le sonde di RNA come riboprobes possono essere utilizzati anche nelle nostre sonde di DNA basata garantire una migliore compromesso tra la qualità del segnale, specificità e facilità d'uso.
Infine, l'immagine 3D acquisition è essenziale per ottenere le informazioni spaziali richieste in questi grandi cellule, e può essere eseguita utilizzando una varietà di microscopi a fluorescenza, come il microscopio apotome o microscopi a epifluorescenza dotato di deconvoluzione come il Deltavision (GEH), o altri microscopi adatto per sezioni di tessuto per immagini, e di grandi dimensioni (> 20 micron) TGC. Va notato che un singolo loci copia di DNA, il segnale rilevato dal puntata nascente FISH RNA o DNA FISH non può essere facilmente rilevata mediante microscopia confocale.
In conclusione, i metodi che descriviamo qui dovrebbero essere utili sia per l'analisi dettagliata di TGS in un contesto di sviluppo, ma anche in altre situazioni di malattia. Molti geni che sono coinvolti nello sviluppo e nella funzione di TGC nei roditori sono conservati tra i roditori e gli esseri umani, come i fattori di trascrizione, proteasi e molecole di adesione cellulare 21. Topo TGC sono un modello cellulare per i geni che regolano studiano placenta uno sviluppod quindi dare intuizioni patologie placentari umane. Inoltre, a causa del fatto che queste cellule sono endoreplicating e poiché alcune cellule tumorali impegnarsi programmi endocycle, oltre ai processi di amplificazione genica, i metodi che descriviamo dovrebbero anche essere utile in indagini monocellulari necessari per esplorare meccanismi che portano alla genoma instabilità nelle cellule tumorali .
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Sophie Gournet per un aiuto con le illustrazioni, Julie Chaumeil per aver letto il manoscritto, l'impianto di stabulazione degli animali e la piattaforma di imaging dell'Unità. Questo lavoro ha ricevuto sostegno nell'ambito del programma «Investissements d'Avenir» lanciato dal governo francese e attuato da ANR con i riferimenti ANR-10-LabX-0044 e PSL ANR-10-IDEX-0001-02, il 7 ° PQ EpiGeneSys no. 257.082 rete di eccellenza a EH, un ERC Advanced Investigator Award no. 250367 e 7 ° PQ SYBOSS UE concessione n. 242129 a EH Gli autori vorrebbero riconoscere il cellulare e tissutale Imaging Piattaforma della genetica e dello sviluppo Dipartimento di Biologia (UMR3215 / U934) del Institut Curie, membro del France-Bioimmagini (ANR-10-InSb-04), per un aiuto con la luce microscopia.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18×18 | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22×22 | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20°C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
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