の新生RNA FISHによる転写分析<em>インビボ</em>栄養膜巨細胞または<em>インビトロ</em>栄養膜コーン外植片の短期文化

動物の手順はキュリー研究所（CEEA-IC）のプロトコル（C 75-05-18）の承認制度的動物管理使用委員会に合わせて行われました。仕事はまた、遺伝子組換え生物（契約番号5549CA-I）の使用のための高等教育と研究のフランスの省からの承認の下で行われています。 凍結切片の調製シェイら 、12に記載されているように自然にF1 C57BL / 6のx DBA / 2Jマウスを排卵から胚を収集します。妊娠（E7）の7日目に、頚椎脱臼により8-12週齢のマウスを生け贄に捧げます。全体受胎すなわち脱落膜12を収集します。 シェイらに記載されているように、E7の受胎を分離します。、12。 PBSを含む60ミリメートルペトリ皿にそれらを配置します。 クリオスタット切片のためのE7マウス受胎をフリーズします。 ガラスパスツールピップを使用して、高さが適合したアルミ箔ウェル1cmの（ '自家製'を準備しますら）。この小さな容器の底部に組織凍結培地のドロップを堆積させます。正しい方向に受胎を堆積させる（すなわち、長手方向のセクションの受胎は、その水平方向に維持する必要があります）。 組織は凍結培地とよく含む受胎を埋めます。それが白くなるまで数秒間液体N 2中のブロックを浸す-それはゆっくりとフリーズすることを可能にするために液体N 2以上の蒸気中の鉗子でそれを一時停止します。続いて、（数ヶ月間保存することができます）-80℃で凍結バイアルとストアにブロックを転送します。 クライオセクショニングする前に、30分間のクライオスタットに-20℃で受胎を含む凍結したブロックを配置します。 8ミクロンの厚さの凍結切片を実行します。デポジット効率的な添付ファイルを有効にするには、スライド上の4つのセクション。 18×18 mm 2のカバーグラスの下に収まるほど近いセクションを配置します。 の品質をチェックセクション（無傷や傷なし）と実体顕微鏡で胚（縦断面）の向きとは、さらなる分析のために適切なセクションを選択します。可能な限り迅速にコプリンジャーにそれらを堆積し、（3.3.2を参照）RNA FISHを行います。 セカンダリTGCsの調製受胎を分離し（1.1と1.2を参照してください）​​。 E7栄養膜円錐（EPC）を解剖実体顕微鏡と滅菌PBSを含むペトリ皿を使用してください。鉗子で脱落膜を解剖。ピアース離れて脱落膜の両側を引き裂くためのサンプルとオープン鉗子。 胚を殻から取り出します。適切な胚からEPCを分離するために、はさみのようなアクションで閉じられた微細な鉗子（デュモン第5号）のヒントを参考にしてください。絨毛膜と卵黄嚢から母体の組織から分離するだけでなく、完全にきれいサンプルを得るために特別な注意を払ってください。 PBSでEPCの外植片を洗浄します。 少しスプーンで、転送個体は4 – WELにEPCを解剖しました培地中の滅菌カバースリップを含むLプレート。 EPCは短期文化からTGCsを求めよ。 カバースリップを含む4ウェルプレートを準備します。火炎乾燥し、エタノール中に浸漬することによってカバーガラス丸い直径12mmを滅菌します。 各ウェルに0.5ミリリットルEPC培地を追加します（EPC培地：RPMI 1640、15％のFCS、0.1mMの2-メルカプトエタノール、および抗生物質を補充しました）。 預金シングル、培地と一緒にウェル中のカバースリップの中央に解剖-のEPC。カバーガラス上にEPCを適用するために微細な鉗子を使用してください。 37℃、5％CO 2で3-5日間Culturefor。個々の外植片を平坦化TGCs（ 図2A）の単層として広がる伸長を形成しています。 3. R​​NA FISH 注：プロトコルは、Chaumeilらに胚性幹細胞（ESC）について記載したものに基づいて8と第一指と聞いた13されています。 高度なPrepa原液の比 3M酢酸ナトリウム緩衝液pH 5.2を準備します。 4倍生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）で40％（w / v）のデキストラン硫酸ナトリウム、20X BSA、400mMのバナジルリボヌクレオシド複合体（VRC）を含む2×ハイブリダイゼーション緩衝液を準備します。 PBS中のp-フェニレンジアミン、pHが9（w / v）の90％（v / v）のグリセロール、0.1％を含有する封入剤を準備します。 新たに調製されたソリューション PBSで3パーセント新たに調製したパラホルムアルデヒド（PFA）からなる固定液を準備します。 PBS中0.5％トリトンX-100を含有する透過液を調製すると、2mMのVRCを補充しました。 50％ホルムアミド（FA）と2×SSCを混合することにより、洗浄緩衝液を準備し、7.2から7.4にpHを調整します。 2×SSC中1μg/ mlのDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩）からなるDNAカウンター染色溶液を調製します。 FISHのための準備中で固定し、透過処理カバースリップ上の細胞は、5メートルのために1×PBSで細胞を洗浄で。RTで固定液中で10分間（3％PFA）ソリューションを、カバースリップ上の細胞、またはスライド上の胚のセクションを修正しました。 1×PBSで細胞を3回洗浄します。氷氷のように冷たい透過性溶液中で5分間、細胞を透過性。 70％エタノールで細胞を3回洗浄します。 -20℃で70％エタノールで4スライド輸送箱に保管し4ウェルプレート中のカバースリップとスライド。 注：カバーガラスとスライドは-20℃で数ヶ月間保存することができます。板およびそれらを含むボックスは、エタノールの蒸発を避けるためにパラフィルムで密封されなければなりません。 DNAプローブ標識蛍光ヌクレオチドを​​使用して、ニックトランスレーションによってDNAプローブにラベルを付けます。製造業者の指示（ 表1を参照）に従う8。 （DNAの増幅のために、3.4.4を参照）50μlの反応ミックスのため、1-2プラスミドμgの、細菌人工染色体（BAC）または複数置換増幅（MDA）を追加し、17.5μlの水にDNAを2.5μlの0.2 mMのSR-、SG-、Cy5でdUTPを、10μlの10 mMの各dNTPミックス（のdGTP、dATPを、dCTPを）、5μlの10 mMのdTTPを、5μlの10×ニックトランスレーションバッファーと8μlのニックトランスレーション酵素。 暗所で15℃にて16時間インキュベートします。 -20℃で凍結することによって反応を不活性化します。 -20℃で数ヶ月の​​ためのストアプローブ。 MDA 注：BACのDNAについては、古典的な準備の後に得られたDNAの量が低いので、1はMDAを使用することにより、標識の前にDNA増幅のステップを使用することができます。市販のキットを使用し、製造業者の指示（ 表1を参照）に従います。 9.5μlのサンプルバッファーで0.5μlのBAC DNAを混ぜます。 95℃で3分間加熱します。直ちに氷上にクエンチ。氷上で10分を残します。反応緩衝液/酵素混合物を準備します（9.5μlの+ 0.5μlの酵素ミックス）、氷上に保ちます。 10μlのDNAミックス+10μlの反応緩衝液/酵素ミックスを混ぜます。 30℃で少なくとも20時間インキュベートします。 65＆＃で試料10分間加熱して酵素を不活性化します176; C。 -20℃で保存する前に4℃に冷却したサンプル。 消化によってMDAを確認してください。 1μlのMDA、2μlの10×バッファー、2μlのHindIIIおよび15μlのH 2 Oを追加37℃で一晩インキュベートします。正確なDNA増幅を確認するために、0.8から1パーセントアガロースゲル上でゆっくり実行します。高分子量の明確なDNA断片をゲル上で観察されるべきです。 プローブの準備カバースリップまたはスライドあたり0.1または1μgのプローブを使用してください。 注：競争は、 例えば、ほとんどのプローブを必要とする場合、彼らはそれ以外の場合は、クロスハイブリダイズ反復配列を含み、背景を増加させることができるように簡易ベッド-1 DNAの2-5μgのを追加します。 沈殿のために、5μgのサケ精子DNA、1/10量5.2と3倍量のエタノールを3 M酢酸ナトリウムのpHを追加します。 16,000×gでスピンし、25分間、4°C。 70％エタノールでペレットを洗浄し、5分間再びスピンダウン。 コンセントレータ/スピードバックで2分間乾燥したペレット。 100％の形で再懸濁ハイブリダイゼーションのために必要な半分の容量でアミド（カバースリップまたはスライド上の胚のセクションの7μlのための例えば、2.5μl）を。サーモミキサーで振とうしながら37℃で30分間置きます。 75℃で7分間の変性。 氷上でクエンチ、または競争は30〜60分間、37℃で直接置く必要な場合。 2Xハイブリダイゼーション溶液の等量のプローブ溶液を混合します。 ハイブリダイゼーションおよび洗浄脱水; 5分ごとに、1×80％、1×95％と2倍の100％エタノールで逐次洗浄によるコプリンジャーのウェルでカバースリップ、スライド、。完全に乾燥したカバースリップとスライド。 ハイブリダイゼーションのために、ハイブリダイゼーションミックスに直面している細胞を用いて、スライド上に5μlのプローブハイブリダイゼーション混合物を（3.5を参照）を適用し、カバースリップを下げます。スライド上のセクションについては、14μlのプローブハイブリダイゼーション混合物を適用する（3.5を参照）、18×18 mm 2のカバーガラスでカバーしています。 に浸した加湿チャンバー（ティッシュペーパーに入れスライド50％FA / 2×SSC）、暗所で、37℃で一晩インキュベートします。 ハイブリダイゼーション後の洗浄： それを緩めるために、スライド上のカバースリップ上に50％のFA / 2×SSCの1ミリリットルを追加します。スライド（細胞をこすりしないように注意しながら）から慎重にカバースリップを除去し、50％FA / 2×SSCを含む4ウェルプレートにそれをアップセル側に配置します。スライド上のセクションについては、同様の方法でカバースリップを除去し、50％FA / 2×SSCを含むコプリンジャーにスライドを配置します。 それぞれ、カバースリップまたはスライドを42℃または44℃に予め加温した50％FA / 2×SSCで7分間3回の洗浄、それぞれを実行します。 それぞれ、カバースリップまたはスライドを42℃または44℃で5分間ずつ予熱した2×SSCで3回の洗浄を行います。 室温で3分間に1μg/ mlのDAPIで2×SSCで洗浄することにより核を対比染色。 2×SSCで二回洗浄します。 カバーガラスとスライドの取り付け培養TGCsから小さなカバースリップのために、5＆＃を適用181; lは、スライド上のメディアをマウントします。ドロップの上にカバースリップ細胞側を下に置きます。 セクションを有するスライドは、スライド上のメディアをマウント15μLを適用します。ドロップの上に22×22 mm 2のカバーガラスを配置します。 気泡を避けてください。過剰実装ソリューションを拭き取ってください。マニキュア少量のカバーガラスをシール。可能な場合は、画像を-20℃で数ヶ月に直ちにまたはストアアップのためにスライド。 4.顕微鏡および分析蛍光顕微鏡（63X対物レンズ）を用いて0.3ミクロンで3D順次z軸画像を取得し、ImageJソフトウェア14を使用して、3D画像スタックの解析を行います。