Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

Hematopoiese is een complex ontwikkelingsproces waarbij hematopoietische stamcellen (HSCs) knop uit hemogenic endothelium aanwezig in diverse embryonale hematopoietische sites zoals de aorta-Gonade-mesonephros en placenta ^1,2. Het onvermogen cultuur HSCs in vitro voorkomt de grondige analyse van dit proces en de klinische toepassing van deze studies. Om deze beperking te omzeilen, hebben eerdere studies geprobeerd om af te leiden HSC de novo hetzij via differentiatie van pluripotente stamcellen (PSC) ^3, of geïnduceerde plasticiteit in somatische cellen en geregisseerd differentiatie met behulp van het herprogrammeren van media ^4,5. Deze onderzoeken echter genereren geen klinisch veilig engraftable cellen of toestaan ​​studie van ontwikkeling definitieve hematopoiese "in een schotel."

De roman werk die door Yamanaka en collega's voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van somatische fibroblasten provides een kader voor transcriptiefactor (TF) op basis van overexpressie strategieën herprogrammering lot van de cel ^6,7. Dit werk is in verschillende gebieden gevraagd onderzoekers om celtypen van keuze te genereren via TF herprogrammering van gemakkelijk verkrijgbaar somatische cellen. Het doel van de herprogrammering strategie hier beschreven een hemogenic werkwijze uit muizen somatische cellen met een TF gebaseerde herprogrammering benadering met als doel deze bevindingen neerkomt op het menselijke systeem patiëntspecifieke fibroblasten herprogrammeren om humane hematopoiese onderzoeken in vitro en induceren genereren patiëntspecifieke bloedproducten ziektemodel, drug testen en stamceltransplantatie.

De eerste stap om juiste herprogrammering in deze muis te verzekeren werd een reporter lijn die diende als een uitlezing voor CD34 expressie, een bekende merker in endotheliale progenitorcellen en HSCs ontwikkelen. Om dit te doen, werden de huCD34-tTA en TetO-H2BGFP transgene muis lijnen gebruikt om generate dubbele transgene muis embryonale fibroblasten (MEF), nu aangeduid 34 / H2BGFP, dat groene bij activering van de CD34 promotor ⁸ fluoresceren. Dit maakte screening van verschillende TF bekend vereist op verschillende momenten tijdens hematopoietische specificatie en ontwikkeling. Beginnend met 18 TF's in PMX retrovial vectoren (bepaald door middel van literatuur en profilering van GFP label behoud van HSC uit de eerder beschreven 34 / H2BGFP muizen), 34 / H2BGFP MEFs werden getransduceerd met alle factoren en gekweekt op AFT024 HSC-ondersteunende stromale cellen. Na de detectie van 34 / H2BGFP activering, werden TF vervolgens verwijderd uit de herprogrammering cocktail tot de optimale set van TFS reporter activering werd geïdentificeerd. Na deze eerste screen werden de factoren naar een DOX pFUW induceerbaar vectorsysteem voor expressie regelbaar van het TF mogelijk. Aangezien beide DOX controleerbare onverenigbaar (de 34 / H2BGFP cellen en de pFUW induceerbare vectoren), MEF uitwild-type C57BL / 6 muizen werden vereist. Het was ook nodig om een ​​geschikte micro-omgeving te laten hemogenesis om verder te gaan en maak multilineage klonogene voorlopercellen te bieden.

Huidige studies een poging om somatische cellen te herprogrammeren in hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) hebben uiteenlopende niveaus van succes ^9-11 voldaan. Tot op heden heeft het opwekken van zowel muis en mens transplantable HSPCs met de lange termijn en zelf-vernieuwing repopulatie vermogen niet is bereikt met behulp van dezelfde set van TF's. In dit protocol bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de eerder vastgestelde strategie reproduceerbaar hemogenesis induceren in MEFs. We tonen aan dat de invoering van een minimaal aantal TF's (Gata2, Gfi1b, cFos en ETV6) kan aanzetten tot een complex ontwikkelingsprogramma in vitro dat een platform waarmee ontwikkeling hematopoiese en klinische toepassing van hematopoietische herprogrammering verder kan worden onderzocht ¹² verschaft.