Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em> Brucella</em> Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella Spezies gram-negative, fakultativ intrazelluläre Pathogene zur Klasse der α-Proteo gehören. Sie verursachen Abtreibungen und Unfruchtbarkeit in ihren natürlichen Wirten wie Rinder, Ziegen oder Schafe was zu schweren wirtschaftlichen Verlusten in Endemiegebieten. Brucellose ist eine der wichtigsten Zoonosen weltweit verursacht mehr als eine halbe Million neue Infektionen beim Menschen jährlich ^1. Die Übertragung auf menschliche wird am häufigsten durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren verursacht oder durch die Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln wie nicht pasteurisierte Milch. Symptome der fieberhafte Erkrankung sind unspezifisch, was Schwierigkeiten bei der Diagnose von Brucellose verursacht. Wenn unbehandelt, können Patienten eine chronische Infektion mit schwereren Symptomen entwickeln , wie Arthritis, Endocarditis und Neuropathie ^2.

Auf zellulärer Ebene ist Brucella können phagozytische und nicht-Phagozyten und repliziert innerhalb eines intrazellulären einzufallenFach wie die Vakuole -haltigen Brucella bekannt (BCV). Internalisierung von Bakterien erfordert von Rac, Rho Aktinzytoskelett Umlagerungen und direkte Aktivierung von Cdc42 ^3. Innerhalb der eukaryotischen Wirtszelle, verkehre die BCV entlang der endocytischen und trotz der Interaktion mit Lysosomen, zu verwalten Bakterien Abbau ⁴ zu vermeiden. Ansäuern des BCV von der vesikulären ATPase erforderlich , um die Expression des bakteriellen Typ IV – Sekretionssystem (T4SS) ⁵ zu induzieren. Es wird angenommen , dass bakterielle Effektoren sekretiert durch die T4SS wesentlich sind für Brucella ihrer replikativen Nische zu etablieren, da Deletion des T4SS ⁶ oder Hemmung der vesikulären ATPase führen zu Fehlern in der Einrichtung der intrazellularen Nische ^7. Bakterien während der Phase des Handels nicht, bis sie replizieren erreichen ⁸ ein ER-derived vacuolar Fach. Sobald die intrazelluläre Vermehrung auftritt, wird die BCV in cl gefundenose Assoziation mit ER Marker wie Calnexin und Glucose-6-Phosphatase – ^6.

Die molekularen Mechanismen , durch die Brucella Zellen eintritt, vermeidet lysosomalen Abbau und repliziert schließlich in einem ER-ähnlichen Fach bleiben weitgehend unbekannt. Wirtsfaktoren in verschiedenen Schritten der Infektion beteiligt sind vor allem durch gezielte Ansätze oder kleinem Maßstab small interfering RNA (siRNA) Bildschirm ausgeführt in Drosophila – Zellen ⁹ identifiziert worden. Diese haben Aufschluss über den Beitrag der einzelnen Wirtsfaktoren bei Brucella – Infektion , aber wir sind noch weit von einem umfassenden Verständnis des gesamten Prozesses.

Hier Protokolle, die die Identifizierung der menschlichen Wirtsfaktoren unter Verwendung von großen RNA-Interferenz (RNAi) Screening in Verbindung mit automatisierten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildanalyse ermöglichen vorgestellt. Reverse siRNA-Transfektion von HeLa-Zellen durchgeführt wird als described früher ^10,11 mit geringfügigen Modifikationen. Der Endpunkt – Assay deckt einen großen Teil des Brucella intrazellulären Lebenszyklus außer dem Austritt und die Infektion von benachbarten Zellen. Um die Treffer charakterisieren in den Endpunkt-Assay identifiziert, ein modifiziertes Protokoll Faktoren identifizieren, in frühen Schritte der Infektion beteiligt ist, verwendet.

Ein Brucella abortus Stamm, der konstitutiv GFP exprimiert wird für den Endpunkt – Assay verwendet , in denen Bakterien erlaubt werden Zellen für zwei Tage zu infizieren. Während dieser Zeit geben Bakterienzellen, Verkehr auf die ER-abgeleiteten replikativen Nische, und in der peri-Kernraum replizieren. Die hohen GFP-Signal kann dann verwendet werden, um zuverlässig einzelner Zellen nachzuweisen, die replizierende Bakterien enthalten.

Brucella Eintrag in einem Hochdurchsatz – Assay zu untersuchen, ist es wichtig , zwischen intra- und extrazellulären Bakterien zu unterscheiden zu können. Die hier vorgestellte Methode circumvents Differential-Antikörper-Färbung von intra- und extrazellulären Bakterien. Es basiert auf einem Brucella – Stamm zugrunde , ein Tetracyclin-induzierbaren GFP in Kombination mit konstitutiver Expression von dsRed auszudrücken. Das Vorhandensein eines konstitutiven dsRed Marker ermöglicht die Identifizierung aller Bakterien, die in der Probe vorhanden sind. GFP-Expression wird durch die Zugabe des nicht-toxischen Tetracyclin analog Anhydrotetracyclin (ATC) gleichzeitig mit der Inaktivierung von extrazellulären Bakterien durch Gentamicin (Gm) induziert. Während die Zelle undurchlässige Antibiotikum Gm extrazelluläre Bakterien tötet, kann AtC die Wirtszelle eindringen und die GFP-Expression selektiv in intrazellulären Bakterien induzieren. Dieser duale Reporter ermöglicht die robuste Trennung einzelner intrazelluläre Bakterien (GFP und dsRed Signal) von extrazellulären Bakterien (nur dsRed Signal) mit Weitfeldmikroskopie. Um nachweisbare GFP – Expression durch intrazelluläre Brucella zu erreichen haben wir festgestellt , dass 4 h Induktion durch atc führt zu einer ReliLage Signal. Ähnliche Induktionsschemata selektiv GFP in intrazellulären Bakterien exprimieren verwendet wurde zuvor intrazelluläre Shigella ¹² zu studieren.