活体荧光显微镜 (IVFM) 的颅骨是应用与遗传动物模型, 研究造血细胞归巢和植入的骨髓 (BM) 龛。
越来越多的证据表明, 正常的造血是由不同的微提示在 BM, 其中包括专门的细胞龛调节关键造血干细胞 (HSC) 功能1,2。事实上, 更详细的造血微环境的图片现在正在出现, 其中内和内皮龛形成正常 HSC 及其子代的调节功能单元3,4,5.新的研究揭示了血管细胞、脂肪细胞和神经细胞在维持和调节 HSC 功能方面的重要性6,7,8。此外, 有证据表明, 来自不同血统的细胞,即髓细胞和淋巴细胞, 位于 BM 微环境中的特定龛位。但是, BM 微环境及其占用者的完整映射仍在进行中。
表达血统特异荧光标记或转基因小鼠的转基因小鼠菌株, 在 BM 龛的特定细胞中缺乏选定的分子, 现已问世。淘汰赛和血统跟踪模型, 结合移植的方法, 提供了机会, 以完善有关特定的 “利基” 细胞的作用, 明确的造血种群, 如 HSC, B 细胞, T 细胞, 髓细胞和红细胞。这一战略可以进一步强化通过合并使用双光子显微镜的颅骨。通过提供体内高分辨率成像和 bm 颅骨的3维渲染, 我们现在可以精确地确定 bm 中特定的造血亚群的位置, 并评估它们随时间扩展的动力学。在这里, 赖氨酸-GFP 的转基因小鼠 (标记髓细胞)9和 RBPJ 敲除小鼠 (缺乏标准缺口信号)10与 IVFM 结合使用, 以确定髓细胞植入的缺口缺陷 BM 微环境。
活体多荧光显微镜 (IVFM) 是一种强大的成像技术, 允许高分辨率, real-time 成像的组织与深度高达 1mm, 根据组织。当应用于小鼠颅骨, 它允许观察 BM 内造血细胞的行为, 其非侵入性的方式可达60-100 μ m11。本方法用于测定 RBPJ 敲除小鼠缺乏标准缺口信号的植入的正常髓内祖细胞的动力学。
最近我们小组的工作表明, 在 BM 微环境中有缺陷的标准缺口信号会导致类似骨髓的疾病12。利用 Mx1-Cre 诱导重组10, 通过条件删除 RBPJ 的 DNA 结合域 (标准缺口信号下游的临界转录因子), 得到了缺口信令的损失。在本研究中, 使用了 Mx1-Cre/RBPJ 的液氧液/液氧小鼠模型。有条件地删除 RBPJ 的 DNA 结合母题会导致所有凹槽受体的信号丢失。在 Mx1-Cre 模型中, Mx1 启动后的表达是由激活后的 polyI 管理: C 导致诱导靶基因缺失的血细胞以及基质成分的多个器官, 包括 BM, 脾脏和肝脏。
Mx1-Cre+/RBPJ氧液/液氧和 Mx1-Cre–/RBPJ 液氧/液氧小鼠 polyI: C (在此表明 RBPJKO 和 RBPJWT 分别) 照射和移植正常, 野生型造血细胞。从4周开始移植后, RBPJKO 受体发育显著增多继发脾肿大。虽然 RBPJKO 小鼠在移植后8周和以后的时间点, 骨髓中髓祖细胞的比例增加, 但在4和6周, bm 的分析结果并没有显示出它们与对照组相比的髓内含量显著的差异 RBPJWT收件人.这一观察, 连同 Mx1-Cre 在不同的造血器官中表达的事实, 提出了 BM 微环境是否对骨髓表型的启动有直接影响的问题。
为了确定 bm 是否是疾病发展的一个重要的初始部位, IVFM 的小鼠颅骨与 bm 移植 (BMT)、RBPJ 敲除模型和血统跟踪系统结合使用。在特定溶菌酶启动子 (赖氨酸-GFP)9的控制下表达 EGFP 的转基因小鼠被用来获得在 BM 成像后 BMT 的供体细胞。溶菌酶表达是特定于髓细胞和赖氨酸-GFP 标记细胞从普通的髓系祖 (CMP) 到成熟粒细胞膜13。
IVFM 在不同时间点的 bm 表明, 赖氨酸-GFP 细胞与 RBPJWT 和 RBPJKO 受体的 bm 相似, 但在 RBPJKO 受体的 bm 中扩张和嫁接更快。这个区别是戏剧性的在早先时间点 (星期 2) 和减少随着时间 (星期4和 6)。然而, 在这些后来的时间点, 对同一受体的造血室的评价显示, 在 RBPJKO 小鼠体内的铅和脾内循环的髓细胞数量稳步增加, 表明细胞的产量增加从 BM 到循环。赖氨酸-GFP 细胞在移植小鼠骨髓中的定位分析6周后发现髓细胞在 RBPJKO 微环境中的血管中比对照组更远。
总的来说, IVFM 与这些特定动物模型的结合提供了 RBPJKO BM 微环境中髓细胞植入动力学的洞察。本文所描述的实验设计和定量方法是一种可以应用于解决类似问题的范例。例如, 使用其他特定于单元的沿袭跟踪模型 (如 RAG1-GFP14或 Gata1-GFP15小鼠) 可能允许在 BM 中分别遵循淋巴或红祖细胞的行为。
该协议描述了一个实验设计的优化, 以研究活体荧光灯显微镜的造血细胞植入动力学。在这项研究中, 在骨髓细胞或在一个缺口信号有缺陷 bm 的扩张在骨颅骨被跟踪的赖氨酸-GFP 阳性髓细胞后, BMT 到 RBPJWT 或 RBPJKO 受体。这种方法被提出作为一个模型, 可用于解决类似的问题, 如: i), 以确定在 BM 的细胞的其他血统, 如淋巴, 红或巨细胞的扩展和本地化, 通过作为供体细胞造血细胞携带血统特异促进剂驱…
The authors have nothing to disclose.
在印第安纳大学的印第安纳生物显微镜中心进行了成像, 由 Dr. 的导演邓恩。立体定向装置是由 Soonpaa、水井中心的儿科研究的原型设计和制作的。这项工作得到了 NIH/R01DK097837-09 (nc)、NIH/R01HL068256-05 (nc)、NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (nc)、MPN 研究基金会 (nc) 和 CTSI 合作项目 IUSM/圣母院 (nc) 的支持。
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