Özet

Сочетая прижизненной флуоресцентной микроскопии (IVFM) с генетической модели для изучения динамики приживления кроветворных клеток костного мозга ниши

Published: March 21, 2017
doi:

Özet

Прижизненные флуоресцентной микроскопии (IVFM) calvarium применяется в сочетании с генетическим животных моделей для изучения самонаведения и приживления гемопоэтических клеток в костном (БМ) ниши.

Abstract

Все больше фактов указывает, что это нормальное кроветворение регулируется собственный microenvironmental подсказки в БМ, которые включают специализированные сотовой ниши, модулирует критических гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) функции1,2. Действительно более подробную картину гемопоэтических микроокружения теперь формируется, в котором endosteal и эндотелиальных ниши образуют функциональные единицы для регулирования обычных HSC и их потомства3,4,5 . Новые исследования показали важность периваскулярной клеток, адипоциты и нейрональные клетки в сохранении и регулировании HSC функции6,,78. Кроме того есть свидетельства того, что клетки от различных линий, т.е. миелоидного и лимфоидных клеток, дома и проживают в конкретных нишах в BM микроокружения. Однако полное картирование BM микроокружения и его обитатели все еще продолжается.

Трансгенные мыши штаммов, выражая линии конкретных флуоресцентные маркеры или мышей, генетически не хватает отдельных молекул в определенные ячейки BM нишу теперь доступны. Нокаут- и линии отслеживания модели, в сочетании с подходами, трансплантация, предоставляют возможность уточнить знания о роли конкретных «нишу» клетки для определенных гемопоэтических населения, например HSC, B-клетки, Т-клетки, миелоидных клеток и эритроидных клеток. Эта стратегия может быть далее потенцированные путем слияния использование двух Фотон микроскопии calvarium. Предоставляя в vivo изображений высокого разрешения и 3-D визуализации BM calvarium, мы теперь местоположение можно определить точно где конкретных подмножеств гемопоэтических дома в BM и оценить кинетику их расширения с течением времени. Здесь Lys-GFP трансгенных мышей (маркировка миелоидных клеток)9 и RBPJ нокаут-мышей (без канонических Notch сигнализации)10 используются в сочетании с IVFM для определения приживления миелоидных клеток к вырезка дефектных BM микроокружения.

Introduction

Прижизненные multiphoton флуоресцентной микроскопии (IVFM) – это мощный изображений метод, который позволяет с высоким разрешением в реальном времени визуализации тканей с глубиной до 1 мм, в зависимости от ткани. При применении к calvarium мыши, позволяет наблюдения за поведением гемопоэтических клеток в BM неинвазивным способом до 60-100 мкм11. Этот подход используется здесь для определения кинетика приживления нормальной миелоидного прародителями мышей нокаут-БМ RBPJ, не хватает канонические Notch сигнализации.

Последние работы из нашей группы продемонстрировали, что дефектных канонические Notch сигнализации в BM микроокружения приводит к болезни миелопролиферативных как12. Потеря Notch сигнализации был получен условного удаления ДНК привязки домена RBPJ, критических транскрипционный фактор, вниз по течению канонических выемки, сигнализации, используя Mx1-Cre индуцированной рекомбинации10. В этом исследовании была использована модель мышиаргона/lox Mx1-Cre/RBPJ. Условного удаления ДНК связывающих мотив RBPJ приводит к потере сигнализации от всех Notch рецепторов. В модели Mx1-Cre, КРР, выражение управляется промоутер Mx1, активируется после отправления polyI:C, что приводит к индукции удаления целевых генов в клетки крови, а также стромальные компонентов нескольких органов, в том числе BM, селезенки и печени.

Mx1-Cre+/RBPJжидкий кислород/lox и мышейаргона/lox Mx1-Cre/RBPJ индуцированных с polyI:C (расписка указано как RBPJKO и RBPJWT, соответственно) были смертельно облученных и пересадить с нормальной, дикого типа гемопоэтических клеток. Начиная с 4 недели после пересадки, RBPJKO получателей разработали значительное лейкоцитоза, следуют спленомегалия. Хотя RBPJKO мышей представил увеличение доли миелоидного прародителями БМ на неделе 8 после пересадки и позднее момента времени, анализ БМ на 4 и 6 недель не выявить различия в их содержание миелоидных клеток, по сравнению с контролем RBPJWT получателей. Это наблюдение, а также тот факт, что Mx1-Cre выражается в различных кроветворных органов, возникает вопрос, ли BM микроокружения имел непосредственное влияние на возбуждение миелопролиферативных фенотип.

Чтобы определить, является ли BM критическим местом первоначального развития болезни, IVFM мыши calvarium был использован в сочетании с BM трансплантации (БМТ), нокаут-модель RBPJ и линии, системы слежения. Трансгенных мышей, выражая EGFP под контролем конкретных лизоцима промоутер (Lys-GFP)9 были использованы для получения клеток донора, которые могут быть визуализированы в BM изображений после ТКМ. Лизоцим выражение для миелоидных клеток и Lys-GFP знаменует клетки от общей миелоидного progenitor (CMP) до зрелых гранулоцитов13.

IVFM BM в разное время точках продемонстрировали, что Lys-GFP клетки указаны аналогичным получателям БМ RBPJWT и RBPJKO, но расширена и быстрее прижившимися, в БМ RBPJKO получателей. Эта разница была резко на предшествующий момент времени (2 недели) и со временем (недели 4 и 6). Однако в этих более поздних точках времени, оценки гемопоэтических отсека в же получателю показал устойчивый рост числа миелоидных клеток, циркулирующих в PB и локализованы в селезенке RBPJKO мышей, показывающее увеличение производства клеток от БМ в кровоток. Анализ Lys-GFP клетки локализации в BM пересаженных мышей на 6 недель показали, что миелоидных клеток проживало дальше сосудистую в RBPJKO микроокружения чем в элементе управления.

Коллективно сочетание IVFM с этих конкретных животных моделей позволило получить информацию в динамике приживления миелоидных клеток в RBPJKO BM микроокружения. Экспериментальный дизайн и количественный подход, описанный здесь предлагается в качестве парадигмы, которые могут применяться для решения подобных вопросов. Например, может разрешить использование других клеток конкретных линии отслеживания модели, такие как RAG1-GFP14 или15 мышей Gata1-GFP, после поведение лимфоидной или эритроидные предшественники, соответственно, в BM.

Protocol

С разрешения животное уход и использовать Комитет по Индиана школы медицины университета были выполнены все процедуры, связанные с использованием животных. Обеспечить, чтобы придерживаться законодательства о животных экспериментов страны, где выполняется работа. 1. Под?…

Representative Results

Когорты 2 RBPJKO и 2 RBPJWT получателей были отражаться в отдельных изображений сессии в разное время точках: 24 h и 2, 4 и 6 недель после пересадки BM Lys-GFP клеток (рабочий процесс проиллюстрирован на рисунке 1A). В каждой мыши изображения бы?…

Discussion

Этот протокол описывает экспериментальный дизайн, оптимизированный для изучения кинетики приживления гемопоэтических клеток с флуоресцентными прижизненной микроскопии. В этом исследовании расширение клеток миелоидного progenitor в WT BM или в зазубрине сигнализации дефектных BM был отсле?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Визуализация была проведена в центре Индиана для биологических микроскопии в университете Индианы, режиссер доктор Кен Dunn. Стереотаксическая устройство является прототипом разработана и изготовлена, Марк Soonpaa, центр Уэллс педиатрических исследований. Эта работа была поддержана NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (Размыкающих), MPN исследовательский фонд (NC) и CTSI совместных проектов IUSM/Нотр Дам (NC).

Materials

Ketamine cocktail IU School of Medicine Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran Tdb Consultancy TD150-100mg Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer Braintree Scientific CLP-323 75
Gauze sponge Med Vet International PK224 4-ply, 2X2
Nair depilatory cream Commercial store
Saline Med Vet International RXSAL-POD1LT 0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe Fisher Scientific 14-826-79 28g, 1/2cc
Fine Forceps Fine Science Tools 00108-11, 00109-11 straight forcep, angled forcep
Scissor Fine Science Tools 15018-10
Needle holder Fine Science Tools 12002-14
5-0 silk suture Fisher Scientific MV-682 Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish WillCo GWSt-5040
Optical microscope oil Leica
Stereotaxic stage insert  IU School of Medicine Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system  Olympus
Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective  Olympus
Small heating pad Commercial store Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software Bitplane 3/4 D Image Visualization and Analysis software

Referanslar

  1. Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
  2. Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
  3. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  4. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  5. Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
  6. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  7. Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
  8. Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
  9. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
  10. Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
  11. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
  12. Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
  13. Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
  14. Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
  15. Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
  16. Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
  17. Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
  18. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Wang, L., Kamocka, M. M., Zollman, A., Carlesso, N. Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches. J. Vis. Exp. (121), e54253, doi:10.3791/54253 (2017).

View Video