Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Microscopia de fluorescência do multiphoton intravital (IVFM) é uma poderosa técnica de imagem que permite para o de alta resolução, em tempo real de imagens de tecidos com profundidade de até 1mm, dependendo do tecido. Quando aplicado a calvária de rato, permite observar o comportamento das células hematopoiéticas dentro da BM de forma não-invasiva acima de 60-100 μm¹¹. Esta abordagem é usada aqui para determinar a cinética de enxertia de progenitores mieloides normais nos ratos nocaute BM de RBPJ falta canônica de sinalização Notch.

Trabalho recente do nosso grupo demonstrou que defeituoso sinalização de entalhe canônico na BM microambiente conduzem a uma doença mieloproliferativa, como¹². Perda de sinalização Notch foi obtida pela exclusão condicional do domínio de ligação do DNA de RBPJ, o fator de transcrição crítica a jusante de entalhe canônico, sinalização, usar Mx1-Cre induzida por recombinação¹⁰. Neste estudo, utilizou-se o modelo de ratos de^{salmão/salmão} Mx1-Cre/RBPJ. Exclusão condicional do motivo do DNA-ligando de RBPJ resulta na perda de sinalização de todos os receptores Notch. No modelo de Mx1-Cre, Cre expressão é conduzido pelo promotor Mx1 ativado após administração de polyI:C resultando na indução de supressão do gene alvo em células do sangue, bem como em componentes estromais de múltiplos órgãos, incluindo a BM, o baço e o fígado.

Mx1-Cre⁺/RBPJ^{salmão/salmão fumado} e Mx1-Cre^–/RBPJ^{salmão/salmão} ratos induzida com polyI:C (aqui indicado como RBPJKO e RBPJWT, respectivamente) foram letalmente irradiados e transplantado com células hematopoiéticas normais, de tipo selvagem. A partir da semana 4 após transplante, destinatários RBPJKO desenvolveram leucocitose significativa, seguido por esplenomegalia. Apesar de ratos RBPJKO apresentaram aumento percentual de progenitores mieloides no BM na semana 8 após transplante e nos pontos de tempo mais tarde, análise do BM em semanas 4 e 6 não revelou diferenças marcantes em seu conteúdo de células mieloides em relação ao controle RBPJWT destinatários. Esta observação, juntamente com o fato de que a Mx1-Cre é expresso em diferentes órgãos hematopoiéticos, levantou a questão se o microambiente BM teve impacto direto sobre a iniciação do fenótipo mieloproliferativa.

Para determinar se a BM foi um crítico site inicial do desenvolvimento da doença, IVFM da calvária de rato foi usado em combinação com BM transplante (BMT), o modelo de mata-mata RBPJ e uma sistema de rastreamento de linhagem. Ratos transgênicos expressando EGFP sob o controle do promotor (Lys-GFP) lisozima específica⁹ foram usados para obter células de doador que podem ser visualizadas durante a BM de imagem após TMO. Expressão de lisozima é específico para células mieloides e Lys-GFP marca células do progenitor mieloide comum (CMP) para os granulócitos maduros¹³.

IVFM do BM em pontos diferentes do tempo demonstrou que células de Lys-GFP homed da mesma forma para os destinatários BM de RBPJWT e RBPJKO, mas expandido e incorporada mais rápido em destinatários BM de RBPJKO. Esta diferença foi dramática no ponto anterior de tempo (semana 2) e diminuiu ao longo do tempo (semanas 4 e 6). No entanto, estes pontos de tempo mais tarde, avaliação do compartimento hematopoiética do receptor, mesmo mostrou um aumento constante no número de células mieloides circulantes em PB e localizadas no baço de ratos RBPJKO, indicando um aumento da produção de células partir do BM na circulação. Análise de Lys-GFP células localização na BM de ratos transplantados com 6 semanas revelou que células mieloides residiam mais longe da vasculatura no microambiente RBPJKO do que no controle.

Coletivamente, a combinação de IVFM com estes modelos animais específicos fornecidos introspecções na dinâmica das células mieloides no microambiente BM RBPJKO enxertia. O delineamento experimental e abordagem quantitativa descrita aqui é proposto como um paradigma que pode ser aplicado para resolver questões semelhantes. Por exemplo, o uso de outra linhagem de células específicas rastreamento modelos, tais como RAG1-GFP¹⁴ ou¹⁵ ratos Gata1-GFP pode permitir seguindo o comportamento linfoide ou eritroide progenitores, respectivamente, no BM.