La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo
Özet
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
La mitosis es fundamental para el crecimiento y la diferenciación del organismo. El proceso es altamente dinámico y requiere ordenó eventos para llevar a cabo la condensación de la cromatina adecuada, la unión a microtúbulos del cinetocoro, la segregación de cromosomas, y la citocinesis en un marco de tiempo pequeño. Los errores en el delicado proceso puede dar lugar a enfermedades humanas, incluyendo defectos congénitos y cáncer. Los enfoques tradicionales que investigan estados de enfermedad mitótico humanos a menudo se basan en los sistemas de cultivo de células, que carecen de la fisiología natural y contexto de desarrollo / específico de tejido ventajoso en el estudio de enfermedades humanas. Este protocolo supera muchos obstáculos proporcionando una manera de visualizar, con alta resolución, dinámica de los cromosomas en un sistema de vertebrados, el pez cebra. Este protocolo se detallará un enfoque que puede ser utilizado para obtener imágenes dinámicas de células en división, que incluyen: la transcripción in vitro, la cría de pez cebra / recepción, la incrustación de embriones, y la imagen de lapso de tiempo. Optimización y modificaciones de este protocolo también se exploran. Usando H2A.F / Z-EGFP (etiquetas de la cromatina) y mCherry-CAAX (etiquetas de membrana celular) embriones de ARNm de inyección, la mitosis en AB de tipo salvaje, hi1045 auroraB, y hi2865 ESCO2 se visualiza pez cebra mutante. Alta resolución de imágenes en vivo en el pez cebra permite observar mitosis múltiples para cuantificar estadísticamente defectos mitótico y el momento de la progresión mitótico. Además, se observó la observación de aspectos cualitativos que definen los procesos indebidos mitótico (es decir, defectos congression, missegregation de cromosomas, etc.) y los resultados cromosómicas inadecuada (es decir, la aneuploidía, poliploidía, micronúcleos, etc.). Este ensayo se puede aplicar a la observación de tejido diferenciación / desarrollo y es susceptible al uso del pez cebra mutante y agentes farmacológicos. La visualización de cómo los defectos en la mitosis conducen al cáncer y los trastornos del desarrollo será de granmejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad.
Introduction
La mitosis es un proceso celular esencial crítica para el crecimiento, la diferenciación y la regeneración en un organismo vivo. Tras la preparación exacta y la replicación del ADN en la interfase, la célula se prepara para dividirse. La primera fase de la mitosis, la profase, se inicia por la activación de la ciclina B / Cdk1. Profase se caracteriza por la condensación de material de cromatina en los cromosomas. rotura de la envuelta nuclear se produce en la transición entre la profase y prometaphase. En prometaphase, los centrosomas, el centro de nucleación para la formación del huso, comienzan a migrar hacia los polos opuestos mientras extiende los microtúbulos en busca de la unión cinetocoro. Tras la unión, las conversiones hasta final de microtúbulos en el apego y las fuerzas de tensión se orientan los cromosomas que forman una placa de la metafase 1. Si todos los cromosomas están conectados correctamente, el puesto de control conjunto del husillo se satisface, anillos cohesinas que llevan a cabo las cromátidas hermanas juntas se escinden, y los microtúbulos acortar para tirar de la hermanacromátidas hacia los polos opuestos durante la anafase 2,3. La fase final, la telofase, implica el alargamiento de la célula y la reforma de la envoltura nuclear alrededor de los dos nuevos núcleos. La citocinesis completa el proceso de división separando el citoplasma de las dos nuevas células hijas 4-6. La alteración de las principales vías de la mitosis (es decir, punto de control de ensamblaje del huso, la duplicación del centrosoma, cromátida hermana de cohesión, etc.) Puede resultar en la detención de la metafase, missegregation de cromosomas, y la inestabilidad genómica 7-10. En última instancia, los defectos en las vías de mitosis control pueden causar trastornos del desarrollo y el cáncer, que requiere la visualización de la mitosis y de sus defectos en una, vertebrado, organismo multicelular vivo 10-16.
embriones de pez cebra sirven como un gran organismo modelo para la formación de imágenes en vivo debido al tejido transparente, facilidad de microinyección, y el desarrollo rápido. El uso de pez cebra, el objetivo general de este manuscrito esdescriben un método de 5D en vivo (dimensiones X, Y, Z, el tiempo y longitud de onda) de formación de imágenes de mitosis 17 (Figura 1C). El uso de pez cebra mutante defectuoso en diferentes vías mitóticas demostrar la consecuencia de tales defectos. Para este protocolo, Aurora B y ESCO2 mutantes fueron elegidos para ilustrar estos defectos. Aurora B es una quinasa que es parte del complejo de cromosoma de pasajeros (CPC) que participan en la formación del huso y la unión de los microtúbulos. También se requiere para la formación de división surco en la citocinesis 18,19. En el pez cebra, la deficiencia de Aurora B conduce a defectos en la inducción surco, la citocinesis, y la segregación de los cromosomas 20. ESCO2, por otro lado, es una acetiltransferasa que es esencial para la cohesión de cromátidas hermanas 21,22. Se acetila cohesinas en la porción del anillo SMC3 estabilizando así cohesinas para asegurar correcta segregación cromosómica en la metafase-anafase transición 23. La pérdida de ESCO2 en el pez cebra lleva a chmissegregation romosome, hermana prematura separación de cromátidas, la inestabilidad genómica, y dependiente de p53 y la apoptosis independiente 24,25. Debido a la disponibilidad, hi1045 auroraB, y hi2865 ESCO2 pez cebra mutante (en lo sucesivo, aurB m / my ESCO2 m / m, respectivamente) se utilizará para ilustrar esta técnica 25-27.
Acoplamiento microscopía confocal con maquinaria de la célula fluorescente-tagged ha permitido a los investigadores visualizar dinámica de la cromatina y la membrana celular durante la mitosis 25,28,29. histonas-fluorescentes etiquetadas históricamente se han utilizado para visualizar la cromatina. Las histonas son proteínas nucleares compuestas de cuatro pares diferentes (H2A, H2B, H3, y H4) que son responsables de la estructura del nucleosoma que compone los cromosomas 30. Mientras H2B es sin duda el más utilizado para la histona proteínas fluorescentes enel ratón y el cultivo celular, el uso de la histona 2A, Z Familia (H2A.F / Z) ha demostrado también para su uso en el pez cebra 31,32. Concanavalina A y la caseína quinasa 1-gamma por ejemplo, localizar a la membrana celular y se han demostrado eficaces en la visualización de la membrana celular en erizos de mar y Drosophila 33,34. Otros estudios han demostrado que la proteína fluorescente de etiquetado CAAX etiquetas de la membrana celular y tuvo éxito en el pez cebra 31. CAAX es un motivo que es reconocido por las enzimas de modificación post-traduccionales tales como farnesyltransferases y geranylgeranyltransferases. Las modificaciones de estas enzimas causan las proteínas a ser asociada a la membrana, por lo tanto etiquetar la membrana celular 35.
Debido a la utilización anterior en el pez cebra, este protocolo eligió utilizar H2A.F / Z y CAAX para etiquetar la cromatina y la membrana celular. La aplicación de este método permitirá que el investigador para supervisar la mitosis en el nivel de célula individual para observar cromosoma individuodinámicas, como se monitorean así como simultáneamente múltiples divisiones celulares que pueden impactar en la diferenciación de tejidos y el desarrollo. Este artículo se centrará en la formación de imágenes de la dinámica de la segregación de cromosomas durante la mitosis en el nivel de células individuales. Dentro de este manuscrito, la capacidad de observar varias divisiones mitóticas, calcular el tiempo de división, y descifrar los fenotipos mitóticas se ilustra y se describe. Mediante el uso de estos parámetros, fisiológicamente relevantes de datos pueden ser recogidos y aplicados a varios estados de enfermedad afectados por defectos mitótico.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de este método permite inferir ruptura nuclear sobre, formación de una placa de la metafase por adjuntos microtúbulos del cinetocoro, y segregación de las cromátidas hermanas para formar dos nuevas células en vivo y de una manera dependiente del tiempo. La capacidad de observar la mitosis en el pez cebra es ventajoso sobre muestras fijadas y sistemas de cultivo celular, porque las células están siendo fotografiado en la fisiología natural, el tejido es transparente, que permite para las proteín…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
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